基因与病毒复制的关系.docx

3.1 引言 本实验所研究的BP基因，选自本实验室博士所做的口蹄疫病毒急性感染BHK-21细胞和持续感染BHK-21细胞的基因芯片检测结果。张虎博士已在他的毕业论文中初步验证了BP基因在口蹄疫病毒持续性感染（持感细胞）中下调，急性感染细胞（急感细胞）中上调，与芯片结果相符。我们选取BP基因做进一步的深入研究，期望能通过检测其在持感细胞不同代次中表达量随病毒变化的情况，阐明口蹄疫病毒持续感染与细胞共存的关系，也希望得到该基因影响病毒的复制和持感稳态的结果。单细胞实时荧光定量PCR技术可以在单个细胞中检测多个基因的表达情况，单细胞水平的检测可以揭示在群体情况下被平均化掩盖的关键现象，是目前用于细胞基因转录谱分析的先进技术。如有研究报道，通过单细胞转录谱分析揭示人诱导多能干细胞的异质性 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA ( HYPERLINK \l _ENREF_84 \o Narsinh, 2011 #172 Narsinh et al., 2011)，细胞所处的微环境决定了细胞在病毒感染过程中表现出的异质性 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA ( HYPERLINK \l _ENREF_116 \o Snijder, 2009 #153 Snijder et al., 2009)，这些关键现象都是在群体水平的研究中无法展现出来的问题。而单个细胞中基因表达量的绝对拷贝数更能真实的反应群体细胞之间存在的差异性，而这种差异性在其与病毒或者环境的相互作用时，是否会提供进化上的优势，也是我们研究持续感染时所感兴趣的科学问题。 3.2 材料和方法 3.2.1 材料 1．病毒与细胞系 O型口蹄疫病毒来自中国农业科学院兰州兽医研究所。 叙利亚仓鼠肾细胞系（BHK-21）来自中国典型培养物保藏中心。 持续感染口蹄疫病毒的BHK-21细胞系（PI）由本实验室黄璇博士建立并保存。 2．试剂 细胞培养基（MEM），胰酶和磷酸盐缓冲液（PBS）均购自GIBCO公司。 胎牛血清购自四季青公司。 RNase-free H2O 购自TaKaRa公司。 ReverTra Ace??qPCR RT Kit，THUNDERBIRD? SYBR?qPCR Mix，THUNDERBIRD? Probe qPCR Mix均购自TOYOBO公司。 细胞总RNA裂解液Trizol购自Invitrogen公司。 苯酚，氯仿和乙醇均购自国药公司。 引物，探针合成自Life公司。 3.仪器 CO2细胞培养箱（2300型）购自Sheldon Manufacturing公司。 生物安全柜（ClassⅡBiohazad safty cabinet）购自ESCO公司。 程控降温仪KRYO 560-16购自Planer公司。 超低温-70℃冰箱和NanoDrop2000c均购自Thermo公司。 普通冰箱购自伊莱克斯公司。 台式小型冷冻离心机购自Eppendorf公司。 荧光定量PCR仪（CFX96）购自Bio-Rad公司。 PCR仪（T-Gradient Thermoblock）购自Biometra公司。 毛细管购自南京泉水教学实验器材厂。 显微操纵仪、显微注射仪、拉针器和磨针仪是Narashige公司的产品。 倒置光学显微镜购自Olympus公司。 3.2.2 方法 TCID50实验 将BHK-21细胞接种于96孔板中，置于37℃ 5%CO2培养箱培养24h，汇合度至70%左右即可进行病毒接种。将收集到的持感病毒进行10倍梯度稀释。弃去96孔板中的上清液，用PBS洗两次，加入不同稀释度的病毒液100μL，每个稀释度感染8个复孔。对照组用100μL无血清的MEM代替病毒液，37℃ 5%CO2培养箱孵育1h，然后补加新鲜的含5%FBS的MEM培养基100μL。置于37℃ 5%CO2培养箱培养72h后，用倒置显微镜观察细胞病变情况，并做记录。最后，按照Reed-Muench公式计算TCID50值。 单细胞的挑取和裂解 1.单细胞贮存液的制备 在挑取单细胞前，需预先分好单细胞的储存液，储存液的配置比例为5%的RNase抑制剂和95%的RNase-free H2O。将混合好的储存液分到RNase-free PCR管中，每管5μL，一批32个PCR管，放入4℃冰箱待用。 2. 单细胞的挑取 所有被挑取的细胞均是在T25瓶中生长至传代汇合度，去掉培养基加入1mL胰酶消化5min细胞变圆脱落后，向培养瓶中加入9mL10% FBS的新鲜MEM培养基中和，充分吹散细胞，调整细胞浓度为104-105个/mL，然后取1mL细胞悬液于直径6cm的无菌培养皿中，进行单细胞的挑取。 用拉针器和磨针仪制作精细的