DNA分子标记用于中药鉴定说课.ppt

2. 参加 PCR 反应的物质 主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和 Mg 2+ 。 （ 1 ）引物 是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。 （ 2 ）酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U( 指总反应体积为 100μl 时 ) ，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 （ 3 ） dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系， dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris-HCl 的缓冲液将其 pH 调节到 7.0 ～ 7.5 ，小量分装， -20℃ 冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。 在 PCR 反应中， dNTP 的浓度应为 50 ～ 200μmol/L ，尤其应注意 4 种 dNTP 的浓度要相等 ( 等摩尔配制 ) ，如其中任何一种浓度不同于其它几种时 ( 偏高或偏低 ) ，就会引起错配。浓度过低还会降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 Mg 2+ 结合，使游离的 Mg 2+ 浓度降低。 （ 4 ）模板 ( 靶基因 ) 质量 是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。 RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或酚 /SDS 法等，要防止 RNase 降解 RNA 。 （ 5 ） Mg 2+ 浓度： Mg 2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200μmol/L 时， Mg 2+ 浓度为 1.5 ～ 2.0mmol/L 为宜。 Mg 2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。 四、生药鉴定常用的DNA分子标记方法 DNA分子标记技术 ⒈以传统的southern杂交为基础的分子标记技术 RFLP限制性内切酶片段长度多态性 ⒉以PCR为基础的分子标记技术 ⑴RAPD 随机扩增多态性DNA ⑵SCAR 测序的扩增区段 ⑶STS 测序的标记位点 ⑷DAF DNA扩增产物指纹分析 ⒊以PCR和RFLP相结合的分子标记技术：AFLP 扩增的限制性内切酶片段长度多态性 ⒋以重复序列为基础的分子标记技术 ⑴Satellite:卫星DNA(重复单位为几百～几千碱基对) ⑵Microsatellite:微卫星DNA(重复单位为2～5碱基对) ⑶SSR：短重复序列 （一）限制性片段长度多态（ restriction fragment length polymorphism ，简称 RFLP ） 生物在进化过程中，由于种种原因引起的基因突变和 DNA 分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，在一处或几处发生某种差异，当这种改变（即使是很小的改变）涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的 DNA 片段长度将发生变化，即限制性酶谱的条带方式将出现不同，产生多态性，称为限制性片段长度多态。 一般应用 Southern 杂交检测这种多态性，将琼脂糖凝胶中的 DNA 转移到硝酸纤维素膜（或其它膜）上，然后再用标记的克隆基因作探针进行杂交，经放射自显影后即可在 X 光片上看到 DNA 多态性了。 该方法试验步骤繁琐（包括 Southern 转移、探针标记、杂交、检测等），又受到探针来源的限制，所需 DNA 样品量大（因没有对 DNA 进行扩增），仅适于 DNA 未明显降解的新鲜材料。 （二）随机扩增多态性 DNA( RAPD) （ random amplified polymorphic DNA ）和任意引物 PCR(AP-PCR) （ arbitrary primer PCR ） RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）是 1990 年美国杜邦公司科学家 J. G. K. Williams 和加利福尼亚生物研究所 J. Welsh 领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。 Williams 称之为 RAPD ， Welsh 称之为 A