DNA重组技术的基本工具教材.ppt

选修3 现代生物科技专题 　 　 正误辨一辩 在基因工程中，可以用DNA聚合酶来代替DNA连接酶 模拟实验 多个EcoRI酶切后的载体与目的基因混合之后，加入DNA连接酶，其连接产物将有几种？(为了方便分析，至多考虑两个分子相连接) 载体与载体之间的连接 目的基因与目的基因之间的连接 如何筛选出含目的基因的重组DNA呢？ 提示：在基因工程的实际操作中，科学家选择的载体往往含有两个或更多的标记基因。 如果在目的基因的插入位置有一个标记基因，当目的基因插入后，标记基因将被破坏而无法表达，从而达到筛选目的。 （1）有一或多个限制酶切点,以便目的基因可以插到载体上 （2）有一个或多个标记 基因，便于筛选 （3）必须能在受体细胞 中稳定保存并具备复制、 表达的能力。（或整合到 染色体DNA上，随染色体 DNA进行同步复制。） （4）对受体细胞无害 （5）大小合适，利于 提取和操作 DNA连接酶 DNA聚合酶 限制酶 DNA水解酶 解旋酶 RNA聚合酶 基因的载体： ←目的基因 pBR322质粒结构 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 标记基因 进行筛选 在基因工程中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。 ①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制。 ②有多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 ③具有标记基因，以便进行筛选。 ④对受体细胞无害、易分离。 ⑤载体DNA分子大小应适合，便于提取和操作。 运载体的作用： 运载体必须具备的五个条件： 作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中 利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制 基因工程的操作工具 载体的特点： 目的基因所在片段 运载体 PStⅠ DNA连接酶 重组DNA 运载体自连 目的基因 自连 CTTAA G AATTC G CTTAA AATTC G G PSt Ⅰ 目的基因与运载体连接 pBR322质粒结构 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 标记基因 进行筛选 限制性内切酶 识别序列 外源基因连接 PStⅠ PStⅠ 自主复制 若干种酶的比较 ? ? ?， ?， 基因的针线──DNA连接酶 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来(形成磷酸二酯键)，这样一个重组的DNA分子就形成了。 (连接“梯子”断口的“扶手”而非“梯子”中间的“踏板”) 基因工程的操作工具 G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否一样呢？ 2、DNA连接酶的种类： E.coli DNA连接酶：连接黏性末端 （来源：大肠杆菌） T4 DNA连接酶：连接黏性末端和平末端 （来源：T4噬菌体） T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低 基因工程的操作工具 “分子缝合针” ——DNA连接酶 作用： 形成磷酸二酯键（两个DNA片段末端之间） G A A T T C C T T A A G G P A P 联系必修2“DNA复制”的相关知识， 思考DNA连接酶与DNA聚合酶区别。 基因进入受体细胞的载体  ——“分子运输车” 2、种类： 质粒、λ噬菌体的衍生物 、动植物病毒 1、作用：①作为运输工具，将重组基因 导入受体细胞 ②在受体细胞内复制，从而使目的 基因大量扩增。 质粒是裸露的、结构简单、独立于细菌拟核之外，并具有自主复制能力的很小环状双链DNA分子。 质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。 基因工程的操作工具 阅读课本，归纳思考：作为“分子运输车”，需要具备哪些条件？ EcoRI酶切后的载体和目的基因 目的基因 载体 载体与目的基因之间的连接 载体自身头尾相连接（自身环化） 目的基因自身环化 同向插入 ○ ○ 反向插入 ○ ○ 为什么EcoRI酶切后会有这么多种连接产物呢？ 结论：一种限制酶切割后