微生物基因工程剖析.ppt

10 微生物基因工程 10.1 细菌基因工程 10.2 酵母菌基因工程 10.3 其他微生物系统 10.4 微生物基因工程的应用 10.1 细菌基因工程 实现外源基因表达的基本操作 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 基因工程菌遗传不稳定性及其对策 实现外源基因表达的基本操作 启动子选择 pLac:乳糖操纵子 λ噬菌体转录启动子PL、PR? T7启动子 pBAD:阿拉伯糖操纵子 Trp启动子 密码子的偏好性 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 （1）包涵体型异源蛋白质的表达 （2）分泌型异源蛋白质的表达 （3）融合型异源蛋白质的表达 （1）包涵体型异源蛋白质的表达 异源蛋白分离易达到高纯度和高浓度； 异源蛋白的稳定性取决于包涵体的形成速度； 异源蛋白以包涵体形式存在无活性，适合毒性蛋白表达。 （2）分泌型异源蛋白质的表达 具备信号肽，周质内蛋白量较少，利于浓缩和纯化； 周质内蛋白酶种类和量少，利于异源蛋白的稳定； 周质微环境处于氧化态，利于二硫键形成和蛋白质折叠； 有利于去掉N端Met，提高蛋白活性。 （3）融合型异源蛋白质的表达 稳定性大大增加； 分离纯化简单； 表达效率高 基因工程菌遗传不稳定性 重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排或修饰 重组分子不稳定，使部分子代细胞不带质粒 10.2 酵母菌基因工程 酵母宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 酵母菌的蛋白修饰分泌系统 酵母载体系统 质粒载体 酵母整合载体 酵母人工染色体 酵母菌的转化系统 转化方法： 原生质体法、醋酸锂法、电穿孔法、粒子轰击法 标记基因： 酵母菌的表达系统 温度控制表达系统 PHO5启动子 超诱导表达系统 GAL4 严禁控制表达系统 10.3 其他微生物系统 芽孢杆菌 棒状杆菌 假单胞杆菌 链霉菌 蓝藻 10.4 微生物基因工程的应用 药物生产 疫苗生产 食品饲料工业 环境保护 农业生产 * * 分离包涵体过程会有损失； 高浓度变性剂的使用，在复性前要去除。 分泌型蛋白产量低； 也会形成包涵体； 信号肽切除会产生错误。 回收方法： 化学断裂法 酶解法 对策： 改进宿主系统 施加选择压力 控制外源基因过量表达 优化培养条件 固定化 2μm plasmid 整合载体 *