临床免疫实验分析.pptVIP

实验内容 一、淋巴细胞转化实验（操作一） MTT法 二、酶联免疫吸附试验（操作一） ELISA（双夹心法）法检测乙肝表面抗原（HBsAg） 一、淋巴细胞转化实验（ MTT法操作一） 原理 方法 结果 应用 MTT法——四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法 　原理：T淋巴细胞在有丝分裂原刺激下，发生有丝分裂，形成淋巴母细胞。其蛋白质合成与DNA合成及代谢比正常细胞旺盛，活细胞线粒体中某些酶可将MTT还原为蓝黑色甲臜．用ＤＭＳＯ溶解甲臜，在５７０nm处测ＯＤ值，能够反映Ｔ淋巴细胞的增殖转化程度． MTT法 丝裂原 实验步骤 注意事项: 由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。 实验步骤：(本次课完成) 1、制备脾细胞悬液 1）取脾：用1000ul加样器取5ml 培养液放入平皿中.颈部脱臼处死小鼠，酒精消毒，无菌取脾脏，用毛玻璃片磨碎，放在平皿中，隔着纱布吸出细胞悬液放入离心管中，离心1500r/min,20min。弃去上清,加入3mlIMDM培养液，混匀。 2）细胞计数： 取0.2ml 放入一试管中, 加入1.8ml细胞计数液。取20ml填充细胞计数板, 显微镜下计数。计数方法。 3）调细胞浓度到5×10６/ml ：如配制10mL稀释细胞悬液:从细胞悬液中取(2000/X)mL至试管, 加入培养液至10 ml即可。 细胞计数方法 实验步骤（本次课完成） 2、加 板 每孔加入100ml的调好的细胞悬液 1-3孔(对照)加入10%FCS-IMDM 100ml 4-6孔加入20mg/ml的ConA 100ml 7-9孔加入10mg/ml的ConA 100ml 10-12孔加入5mg/ml的ConA 100ml 3、细胞培养：5% CO2 孵箱内37℃培养48h。 4、MTT掺入：在终止培养前4小时（培养44小时）加入MTT (5mg/ml)10ml/孔，继续培养，至48小时终止培养(此步骤由实验小组长完成 )。 实验步骤：(下次课完成) 5、结果测定：弃上清，加入DMSO (100ml/孔)，振荡溶解甲臢颗粒。充分溶解后用酶标仪测定其吸光度值。OD570nm。 淋巴细胞转化实验的应用 检查患者细胞免疫功能 估计疾病的疗效及预后 细胞配型抗原的检查：移植免疫－MLR 免疫药理学：具有免疫调节的药物、保健品、中草药及生物制品 卫生毒理学的研究 二、ELISA（双夹心法）法检测乙肝表面抗原（HBsAg） 【实验原理】 先将已知抗体包被在固相上，洗去未吸附的抗体；加入待检标本，充分作用后，标本中相应的抗原与固相上已知抗体结合，洗去未结合的抗原成分；加入已知的酶标抗体，再洗去未结合的酶标抗体；加底物后，酶分解底物产生呈色反应，根据颜色的深浅判定待检标本中抗原的量。 固相载体 最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性 。 Enzyme 常用的酶 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)。 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)。 葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。　 HRP的底物 邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD) 四甲基联苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine, TMB) OPD OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 OPD本身难溶于水，OPD·2HCL为水溶性。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。 OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色 　 Application of ELISA 目前应用最广泛的免疫学检测技术之一，常用来检测机体的可溶性的抗原或抗体。 敏感性高，可检测微量的的抗体体或激素、细胞因子及粘附分子等抗原性物质。 成品的试剂盒，已广泛用于某些临床疾病的诊断。 常用的ELISA方法 直接法 (Direct ELISA) 间接法 (Indirect ELISA) 夹心法 (Sandwich ELISA) 直接法 夹心法 【实验步骤】 第一次操作，用时25分钟 1、抗体包被：用包被液将抗HBs稀释至适当浓度（2ug/ml），酶标板中1~10孔每孔加100μl，11~12做空白对照（不加样）,将反应板移至温盒内，4℃放置过夜（可保存一周，下次课后续操作）。 第二次操作，下次课完成，用时100分钟 2、封闭：弃去包被液，每孔加入200ul封闭液，11~12孔空白对照,置43℃ 温箱20min。 3、洗涤：弃去包被板孔内液体，用洗涤液注满