PCR的种类及应用要点解析.ppt

PCR的种类及应用 序 * * PCR的历史 操作过程 引物 步骤 PCR的各种变体 PCR的应用 鉴定基因 亲子鉴定 诊断遗传病 克隆基因 诱变 分析远古DNA 鉴定特定表型的突变体基因 比较基因表达量 目录 * * PCR这项技术是由凯利·穆利斯(Kary Mullis)发明，并因此在七年之后，1993年10月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，和反复相同程序的方法，并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。 PCR 历史 * DNA的复制 DNA在复制时，双链DNA解旋成两股分别进行。其复制过程的复制起点呈现叉子的形式，故称复制叉。以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向连续合成，称为前导链(leading strand)；另一条模板链为5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的DNA链，该链称为后随链(lagging strand)。 * * ①5’→3’的聚合作用：不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 ②3’→5’的外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。 ③5’→3’外切酶活性：切除受损伤的DNA，可用于切口平移（nick translation). 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌，能在70-75℃生长.存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。 该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性. Taq DNA聚合酶 * * PCR（Polymerase Chain Reaction） 即聚合酶链式反应，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增。 它可以在试管里建立反应，经过数小时之后，就能将极微量的目的基因或者某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，而无需通过繁琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝，所以有人亦称为无细胞的分子克隆法。 PCR的定义 PCR 操作过程 1、预变性（Initial denaturation）． 　　模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。 　　 2、引物退火（Primer annealing） 　　退火温度一般需要凭实验（经验）决定。 　　退火温度对PCR的特异性有较大影响。 　　 3、引物延伸 　　引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。 　　延伸时间随扩增片段长短而定。 　　 4、循环中的变性步骤 　　循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性： 　　变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 　　 5、循环数 　　大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特炖条带　 6、最后延伸 　　在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 引物设计 设计引物可以采取以下原则： GC所占比例为40％－60％ 两个引物的Tm，相差小于5℃，并且扩增产物的Tm与引物的相差不超过10℃。 黏合温度通常比计算的最低Tm低5℃，但是要根据经验为不同条件下的PCR选