第八章植物种质资源的保存摘要.pptVIP

植物材料（培养物）的选取 物种、基因型、器官、抗寒性、年龄、生理状态等。 植物细胞培养物的生理状态是决定冻后细胞成活率的重要 因素。一般指数生长期和生长延滞后期的细胞抗冻力强，存活率高。 植物材料（培养物）的预处理 为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性，还要对材料进行预处理，总的原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强细胞抗寒力。 目前主要有3种预处理方式： （1）低温锻炼 激活植物体内抗寒机制 （2）继代培养 增加有丝分裂细胞数目 （3）预培养 培养基中加冷冻保护剂或诱导抗寒力物质 植物材料（培养物）的冷冻处理 降温冰冻方法是影响超低温保存效果的关键因素之一。 冷冻的4种方法 快速冷冻法 慢速冷冻法 分步冷冻法 干燥冷冻法 （1）快速冰冻法 将材料从0℃或预处理温度直接投入液氮，其降温速度在1000℃/min以上。这个过程可以使细胞内的水分子还未来得及形成结晶中心就降到了-196℃的安全温度，从而避免了细胞内结冰的危险。此法适用于那些高度脱水的材料，如种子等。 要求细胞体积小、细胞质浓厚、含水量低、液泡化程度低的材料。 （2）慢速冰冻法 将处于0℃或其他预处理温度的材料以0.5-2℃/min的降温速度从起始温度降到-40℃，稳定10分钟后，投入到液氮保存或以此降温速度连续降温至-196℃的方法。逐步降温过程可以使细胞内水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内水分含量减少到最低限度，达到良好的脱水效果，避免细胞内结冰。 这种方法适合于液泡化程度较高的植物材料，如悬浮细胞、原生质体等。 （3）逐级冰冻法 植物材料经过冷冻保护剂0℃预处理后，逐级通过-10，-15，-25，-35，-40℃等，每个温度停留4-6 min左右，然后浸入液氮。 （4）干燥冰冻法 将样品在含高浓度渗透性化合物（如甘油、糖类物质等）培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌空气干燥脱水数小时，或者用褐藻酸钙液泡包裹样品，无菌风进一步干燥，然后直接投入液氮； 或者用冷冻保护剂处理后吸除表面水分，密封于金箔中进行慢冻。 只要脱水足够，细胞内溶液浓度即可达到较高水平因而易进入玻璃化状态。这种方法对某些植物的愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、花粉、茎尖及试管苗等较合适，但对大多数对脱水敏感的材料不适用。 植物材料（培养物）的冷冻贮藏 适宜温度下贮存冷冻材料也很重要。长期内贮存在液氮内的材料，需合适的液氮容器。冷冻贮存的茎尖随保存时间的延长，其生活力可能下降。 植物材料（培养物）的解冻处理 植物材料在超低温贮存过程中所发生的冻害是在冷冻和解冻过程中产生的。 解冻过程中发生的冻害是由细胞内次生结冰造成的。 解冻过程中水的渗透冲击对细胞膜体系造成破坏。 解冻方法 快速解冻法 慢速解冻法 a、快速解冻法 是指将液氮中保存的材料直接投入到37-40℃温水浴中进行解冻的方法。解冻的升温速度为500-750℃/min，迅速通过再次结冰的温度区（-50℃- -10℃），大多数植物材料可采用此种方法。 b、慢速解冻法 将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解冻的方法。适宜细胞含水量较低的材料。 如木本植物的冬芽。 化冻后的材料需立即进行洗涤， 以除去材料组织中高浓度的冷冻保护剂，避免影响材料恢复和继续生长。最常用的洗涤方法是用含浓度为1.2 mol/L蔗糖的基本培养基25℃下处理10min，也有用浓度为1.5～2.0mol/L的山梨醇的培养液进行保护剂成分的洗涤 植物材料（培养物）的再培养 经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。 冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养1～2周，在转入正常光下培养。 再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等以利于生长的恢复。 组织材料 预处理 加冷冻防护剂0℃ 慢冻法-40℃或-100℃ 逐级冰冻法 快冻法 种质库（-196℃） 解冻 再培养 细胞生长、植株再生 超 低 温 保 存 的 程 序 超低温保存后细胞或组织活力检测 冻后存活率的快速鉴定通常采用FDA荧光双醋酸法、TTC(氯化三苯四氮唑)还原法、Evans(伊凡蓝)法等。 存活率公式 存活率（%）= ×100% 重新生长的细胞（组织）数 解冻的细胞（组织）数 （四）缓慢生长保存 1)高渗保存法 利用培养基的高渗透压，减少离体培养物吸收养分