来自嗜热芽孢杆菌K91GDSL19、Beta-lactamase16技术报告.docVIP

PAGE \* MERGEFORMAT15 学科分类号（二级）180.61 本科学生毕业论文（设计） 　 题　　目 来自嗜热芽孢杆菌K91 GDSL19、 Beta-lactamase16基因的克隆表达 姓　　名　　　　　　　　　　 学　　号　　　　　　　 院、　系　　　　　　　　 专　　业　　　　　生物科学　　　　 指导教师　 　 　　　　　　 职称（学历） 讲师（博士） 来自嗜热芽孢杆菌K91 GDSL19、Beta-lactamase16 基因的克隆表达 摘要：GDSL19基因编码GDSL酯酶，应用于医药，食品，生物化学等领域，具有催化酯化合成，酯水解酯交换的潜力；Beta-lactamase16基因编码青霉素酶，它们广泛应用于处理青霉素超标牛乳、酶联免疫分析、生物传感器和前药研制等领域。本研究以云南腾冲温泉中筛选出的嗜热的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis K91）为研究对象，提取此菌株基因组，利用PCR技术克隆得到GDSL19和Beta-lactamase16基因，两条基因片段分别连接表达载体pEASY-E2上，在大肠杆菌BL21中成功表达，但经过酶活检测得知没有酶活。本研究能够为极端环境下的嗜热微生物酶资源开发和利用提供理论指导。 关键词：GDSL酯酶；β-内酰胺酶；异源表达 绪论 GDSL酯酶 酯酶属于???水解酶家族，具有多功能性，如广泛的底物特异性和区域专一性。它们广泛应用于医药，食品，生物化学等领域，能够催化酯化合成，酯水解酯交换。GDSL酯酶具有一个明显的GDSL序列，不同于在很多酯酶中发现的GxSxG序列。GDSL酶不具有所谓的亲核试剂的弯头。研究表明GDSL水解酶的活性中心具有柔性，在底物结合后其构想可以发生改变，非常像Koshland提出的诱导契合理论[1]。酶活性中心的这种柔性，使得活性中心在与不同底物结合时都可以获得最佳的构象，以保证催化反应更加高效的进行[2]。 很多细菌的酯酶或脂肪酶属于GDSL水解酶家族，大肠杆菌硫酯酶（蛋白酶I）TEP-I是GDSL家族中研究较为深入的一个。TEP-I 基因克隆于大肠杆菌 JM109 菌株，该蛋白对于乙酰辅酶 A 酯类以及多肽具有广泛的水解能力[3]。同时，作为一个酯酶，它又可以水解一些芳香族酯类，比如乙酸萘酯，丁酸萘酯，乙酸苯酯，乙酸苯甲基酯，以及对硝基苯酚酯类[4]。 从革兰氏阳性菌Xanthomonas vesicatoria DSM 50861中克隆得到一个新的酯酶基因，被命Xv_Est，在大肠杆菌中获得了表达[5]。该酯酶的底物特异性偏好于较短侧链的酯类，对小于 C8的对硝基苯酚酯有活性，不能够水解长链的甘油三酯（典型的脂肪酶的底物）。同时，它还可以水解长链的酯类，比如说 1-hydroxy-pyrene-3,6,8-trisulfonic acid (HPTS)-fatty acidesters，对于1-methyl-prop-2-ynyl acetate (93% EE) 还显示出了对映体选择性，即立体构象特异性。 β-内酰胺酶 自从1929年FLEMING发现青霉素以来，人类对细菌感染病的治疗有了很大改观。但人们很快发现致病菌出现了抗药性，且抗药性越来越强，这种抗药性不但使致病菌对公共卫生的危害增大，而且使疾病的治疗和新药研发的费用成为昂贵的负担[6]。经研究发现细菌对β-内酰胺类抗生素的抗药机制有以下几种:(1)细菌表面出现的渗透屏蔽，使药物不能达到作用部位而造成耐药;(2)抗生素作用的靶酶，即存在于细菌细胞膜上的青霉素结合蛋白 (penicininbondingProtein，PBP)量的减少、缺失、结构的改变，使细菌产生β-内酰胺类抗生素耐药;(3)细菌产生β-内酰胺酶，使β-内酰胺环被酶解而失去活性。在以上抗药机制中，产生β-内酰胺酶是导致细菌对β-内酰胺类抗生素耐药性的最主要原因[7]。 在《中国药学词典》中，β-内酰胺酶（Beta-lactamase）被定义为一类能水解青霉素和头孢霉素类抗生素的β-内酰胺环，使它们失活的水解酶[8]。β-内酰胺酶依据分子量、等电点、氨基酸的组成与序列、底物的特异性、酶活性（Km）和最适pH值的不同，可被分成不同的类型[9]。由于分类的依据不同，其分类方法有多种。目前被广泛接受的分类方法是1980年由Amble建立的分类系统[10]，该方法主要依据酶的活性中心及氨基酸序列的不同，将β-内酰胺酶分为A、B、C和D四种类型，其中A型酶为主要作用于青霉素类的青霉素酶；B型酶是依赖金属离子而保持活性的酶，被称为金属酶，包括可以水解亚胺硫霉素的碳氢类抗