细胞工程-第五章细胞融合与单克隆抗体资料.pptVIP

* * 视频：单克隆抗体的制备 * 动物细胞融合技术 B 、BB 、B瘤 、瘤瘤 、瘤 只有杂种细胞才能活 动物细胞培养 五、单克隆抗体制备过程 获得产生相应抗体的B淋巴细胞 筛选阳性杂交细胞 HAT培养基 单抗的纯化、检测 * 单抗纯化方法： 盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法 * 用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。 血清 50%饱和度硫酸胺 上清 （清蛋白） 沉淀（球蛋白） 33%饱和度硫酸胺 上清 沉淀 拟球蛋白 r球蛋白 （1）盐 析 法 * （2）凝胶过滤法 干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。 交联葡聚糖凝胶(Sephadex) 琼脂糖凝胶(Sepharose) * （3）离子交换层析法 DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂 CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂 * （4）亲和层析法 将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原） * 单克隆抗体特性 理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备 * 单抗鉴定方法： 效价 （凝集反应、Elisa、放免） 特异性（免疫荧光、 Elisa 、间接血凝、免疫印迹） * 原理：Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 * 考马斯亮蓝染色蛋白电泳结果 * * （2）免疫组织化学技术 * 第五节 人源单克隆抗体 主要困难 （1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力； （2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的； （3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。 * EB病毒转化技术 人鼠杂交瘤单克隆抗体 人人杂交瘤单克隆抗体 转基因动物制备单克隆抗体 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体 人源单克隆抗体制备 * * 全球单抗市场情况 * 2008年单抗药物销售前5位名单 全球单抗市场情况 排名 药品名称 公司 销售额/亿美元 适应症 1 利妥兮单抗 罗氏/基因泰克 13.49 非何杰淋巴瘤 2 英利昔单抗 强生/先灵葆雅 12.46 类风湿等免疫性疾病 3 曲妥珠单抗 罗氏/基因泰克 10.14 乳腺癌 4 贝伐单抗 罗氏/基因泰克 8.92 结直肠癌 5 阿达木单抗 雅培 8.03 类风湿等免疫疾病 * 国内单抗市场 2008年 * * 本章小结 细胞融合又称体细胞杂交，是两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。 细胞融合的方法主要有生物法（仙台病毒法）、化学法（聚乙二醇 法）和物理法（电融合法）。 杂合细胞的筛选方法主要有基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂 种筛选、基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选、由温度敏感型细胞 组成的杂种细胞的筛选及具有所需性状杂种细胞的