细胞培养基本技术及免疫细胞的培养方法.解读.docVIP

细胞培养 细胞培养基本技术 一、免疫细胞分离技术 1、淋巴细胞的分离 取肝素抗凝血1m1加Hanks液1m1稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min水平离心20min，管内分为4层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks液洗两次，每次2000r／min离心10min，最后用RPMI l640培养液将细胞配成2×106／m1的细胞悬液备用。 2、T细胞及B细胞的分离 将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMI l640培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B细胞，并用少量的RPMI l640培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。 3、CD4细胞及CD8细胞的分离 （1）CD4细胞的分离：将一定量的T细胞悬液通过一根SephDdexC—10柱，然后用少量的RPMll640培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4细胞。 （2）CD8细胞分离：用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。然后将已标记有抗CD8单克隆抗体的T细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1加入上述的平皿内，4℃放置2小时，用PBS轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640培基中备用。CD4细胞亦可用此法分离。 4、单核巨噬细胞的分离 单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃ C02温箱内温育1小时，然后用RPMI 1640培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。 二、肿瘤细胞株的传代培养 传代细胞是指来自人或动物的肿瘤组织或正常组织的细胞，其染色体组型发展为非整倍体或二倍体低于75％，这种非整倍体细胞在体外具有无限传代的生命力，通常具有异种移植的能力和较广泛的病毒敏感性。传代细胞的特性是：①具恒定繁殖特性，少数细胞即有繁殖能力，在琼脂内能形成克隆；有的为贴壁生长，有的悬浮生长。②染色体组型为异倍体，大多数人源细胞染色体为60－70条左右。③保留种属特异性，但组织分化性与脏器特性均消失。④具致癌性。由于传代细胞繁殖迅速，易获取、易保存，已为各实验室广泛采用。 1、HeLa细胞的传代培养 试剂与仪器 ●HeLa细胞。 ●HaMks液，0．25％胰蛋白酶，0．02％EDTA，生长液，青、链霉素(PS)，5．6％ NaHC030 ●小三角烧瓶，培养瓶，无菌吸液管(5m1及1m1)、毛滴管，废液瓶等。 方法与步骤 （1）选生长良好的HeLa细胞一瓶，轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起浮着在细胞表面的碎片，然后连同生长液一起倒出，用Hanks液洗一次。 （2）从无细胞面侧加入0．25％胰蛋白酶液或胰蛋白酶一EDTA消化液4－5ml，翻转培养瓶，使消化液浸没细胞1min左右。 （3）翻转培养瓶，放置5—10min，为促进细胞的消化，可以加入37℃预热的消化液，或在细胞面向上时，用手掌贴着细胞面的瓶外壁，待肉眼观察细胞面出现布纹孔状为止。 （4）倒出消化液，如系EDTA消化，需沿细胞层的对面加Hanks液4．5m1洗涤，洗涤时轻轻转动培养瓶，让液体在瓶内慢慢流动，以洗掉消化液；如系胰蛋白酶消化，倒掉胰酶后可不洗涤。 （5）沿细胞面加入适量新配制的生长液，洗下细胞，并用吸管吹打数次，使细胞分散开，按1：2或1：3分配传代培养。 （6）37℃培养，接种后30min左右可贴壁，48小时可换生长液，一般3—4天可形成单层，形成单层后再换维持液供试验用。 [附] （1）生长液： ①MEM液63％，乳蛋白水解物20％ 小牛血清 15％ 双抗(P、S)1％ 用5．6％ NaHCO3溶液调整pH至7．2—7．4 ②199液 70％ 乳蛋白水解物 18％ 小牛血清 10％ 双抗(P、S) 1％