中华绒螯蟹基因表达谱及生殖相关基因克隆、表达模式研究分析.docVIP

中华绒螯蟹的基因表达谱及生殖相关基因的克隆、表达模式研究 【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是中国淡水渔业的重要组成部分,它已经成为中国的一道传统美食。由于它肉质细嫩,味道鲜美,营养丰富,在全球市场供不应求且价格不菲。它是我国重要的经济水产养殖品种,该蟹的养殖已成为我国水产养殖的支柱产业。在过去的几十年中,随着密集化养殖的发展,由细菌、病毒和类立克次氏体属微生物所引发的各种疾病,以及性早熟、个体小型化以、种质退化等现象在中华绒螯蟹种群中频频发生,并且对螃蟹的质量造成灾难性损失,已经成为限制该蟹养殖业发展的重要瓶颈。因此认为了解其免疫防御机制、免疫因子特征,以及生殖生物学尤其是生殖的分子机理的研究,对螃蟹养殖的疾病控制和健康管理很有帮助,并为该蟹养殖过程中的人工生殖调控提供理论保障。本论文试图从分子角度来研究中华绒螯蟹的免疫防御机制以及雄性生殖机理,以期能有效突破中华绒螯蟹人工养殖的瓶颈,进一步促进该蟹养殖业的持续发展。本研究借助分子生物学和生物信息学手段,首次完成对中华绒螯蟹肝胰腺cDNA文库的构建和表达序列标签(EST)的分析,并利用先进的Solexa测序技术,对中华绒螯蟹副性腺组织进行转录组及microRNA的大规模测序并分析其基因表达情况。不仅丰富了中华绒螯蟹的基因组数据库,同时筛选出许多免疫相关及生殖相关的的基因序列。通过对所测高通量数据分析的注释结果,结合已有物种生殖相关基因的研究现状,分析、筛选与该蟹生殖发育相关的部分重要基因；利用RACE和WORKING等技术,获得这些基因的cDNA全长以及基因的结构；利用realtimePCR研究不同基因在不同组织中以及同一组织不同发育阶段的表达情况,探讨这些基因在整个生殖发育过程中的调控作用。这些研究为了解中华绒螯蟹生殖机制提供了基础资料,同时也为深入探讨该蟹雄性生殖机理提供了重要的参考。主要研究结果如下：1采用常规cDNA文库构建技术,成功构建了一个中华绒螯蟹肝胰腺的EST文库并且获得了3,279高质量序列,代表着1177个一致性序列。超过一半的一致性序列被鉴定是这一物种的未知的新基因。有很大一部分一致性序列(49%)在新发布的数据库中找到它们的同源物,这些同源物对于进一步的功能研究很重要。总结了与代谢和免疫相关的基因,借以考察肝胰腺的两种重要功能：代谢和免疫。为中华绒螯蟹的深入研究打下基础,包括转录组、物理图谱和整个基因组测序。展示了中华绒螯蟹与免疫密切相关的转录组和基因的重要性质。本文重点找到了与机体免疫相关的基因,分为5大类,包括蛋白酶类、抗菌肽、压力蛋白、抗氧化蛋白和其它与免疫相关的基因进行重点分析。蛋白酶类和他们的抑制剂在无脊椎动物抗感染反应中的重要性越来越明显。它们可能在应对侵染性蛋白的体液免役反应过程中表达,这些侵染性蛋白是由侵染性抗原产生的。文库中发现了1种抗菌肽,抗脂多糖因子。压力蛋白包括铁蛋白、金属硫蛋白、热激蛋白70、胞溶质蛋白A。硒与谷胱甘肽系统在抗氧化防御体系。以及p-1,3-葡聚糖结合蛋白、C型凝集素、血蓝蛋白、干扰素等,都对中华绒螯蟹的免疫有着重要作用。2从雄性中华绒螯蟹的副性腺组织中提取并分离mRNA,经超声破碎和随机引物反转成cDNA片段,利用Solexa测序(sequencingbysynthesis)技术,对这些组织的RNA转录组进行全面测序；用生物信息学的手段和方法,对测序数据进行转录谱分析,分析各组织的基因表达情况,进一步综合各组织之间基因表达的相关性,探讨不同组织在该蟹雄性生殖过程中的作用及调控模式。共获得33,221,284条reads,包含2,657,702,720nt碱基,GC含量55.19%。通过软件组装拼接得到85,913条contig,将所有contig按序列长度从小到大排序,其中40,977条(47.70%)contig集中在100-200nt的长度.从第一条序列开始累加计算contig总长,所有contig的总长度为18,750,722。通过对Unigene的功能注释,其中有1713条基因条注释到Generalfunctionpredictiononly,注释上Translation,ribosomalstructureandbiogenesis有952条基因,与Transcription相关的有869条Unigene。关于Posttranslationalmodification,proteinturnover,chaperones和Replication,recombinationandrepair的基因分别有802和789条。KEGG是基因组破译方面的数据库。附性腺有1704条基因(14.99%)参与Metabolicpathways,675条基因参与Regulationofactin