基因组学第4章概述.pptVIP

第4章 基因组测序与组装 基因组测序的终极目标是获取目标生物基因组的完整DNA序列。 荧光染料标记物 毛细管电泳(capillary electrophoresis) 4.2 基因组测序4.2.1 基因组测序的策略 1）作图测序 (map-based sequencing): 按照DNA克隆绘制的物理图分别在单个DNA克隆内部进行测序与组装，然后将彼此相连的大分子克隆按次序搭建支架，最后以分子标记为向导将搭建好的支架锚定在基因组整合图上。 2）鸟枪法测序(shotgun sequencing)：将整个基因组DNA打断成小片段后将其克隆到载体中，然后随机挑取克隆进行测序，以获得的序列构建重叠群。进一步搭建序列支架，最后以分子标记为向导将序列支架锚定到基因组整合图上。 基因组测序覆盖面(coverage): 随机测序获得的序列总长与单倍体基因组序列总长之比，覆盖面越大，遗漏的序列越少。 覆盖面和丢失率之间测算的公式： P0=e-m m为覆盖面；e为自然对数底数；P为丢失的概率 序列间隙缝合 基因组序列组装有关的概念 1) BAC末端顺序(BAC-end sequence) 一个BAC克隆插入片段两端的已测序的顺序,不包括内部序列. 可用于确定BAC的排列方向以及重叠群(contig)在支架(scaffold)中的排列方向. 2) 重叠群(contig) 一群相互重叠的克隆或DNA序列,可以是草图序列或精确序列(finished), 包括连续的(内部无间隙)或不连续的(内部含间隙)DNA序列. 3) 支架(scaffold) 一组已锚定在染色体上的重叠群, 内部含间隙或不含间隙. 4) 草图序列(draft sequence) 人类基因组测序计划定义为经Phred Q20软件认可覆盖测序克隆片段3-4倍的DNA序列. 含间隙或无间隙, 排列方向和位置未定. 5) 完成序列(finished sequence) 顺序差错率(错误碱基数)低于0.01%的DNA序列, 排列方向确定,内部不含间隙, 一般测序覆盖率在8-10个单倍体基因组. 引自NCBI, Revised November 6, 2003 草图序列 草图序列可分为3个等级: Phase 0: 测序覆盖面一次的DNA序列; Phase 1: 测序覆盖面3-4次的BAC克隆, BAC及内部片段的位置和排 列方向未定. Phase 2: 测序覆盖面3-4次的BAC克隆, BAC及内部片段的位置和排 列方向已定. 完成序列 1) 完成顺序系指已测序的, 每10000 个碱基中出现一个差错, 且内部不存在间隙 的DNA顺序. 2) 完成顺序也称为Phase 3期顺序. 4.3.1 作图法测序与序列组装 4.3.2 鸟枪法测序与序列组装 老鼠基因组是采取全基因组鸟枪法完成的范例。 老鼠基因组测序共构建了6个插入片段大小不同的基因组文库，分别为2kb、4kb、6kb、10kb、40kb和150-200kb。 利用长度不同插入子克隆两端测序搭建支架 4.3.3 几种不同生物基因组的测序 1) 大肠杆菌基因组测序----图位法 2) 流感嗜血杆菌基因组测序---鸟枪法 3) 果蝇基因组测序---鸟枪法 4) 人类基因组测序---图位法和鸟枪法 5) 拟南芥基因组测序—图位法 6) 水稻基因组测序---图位法和鸟枪法 人类基因组鸟枪法测序的疑问-PNAS 99:4143-4144,2002 人类基因组鸟枪法测序是一个神化? 1) 丢失了20%的基因组顺序, 含有116 000个间隙,平均长2.3 kb. 2) 利用了大量公开发表的人类基因组顺序作为组装的支点,这是一些极其关键的顺序. 3) 耗费: 作图法的费用为, 10%用于BAC作图与亚克隆, 50-60%用于亚克隆测序,覆盖率为5-6个当量, 30-40%用于完成精确顺序测序. 鸟枪法费用为, 利用了发表的BAC物理图,节省了10%的费用. 由于避免顺序丢失, 随机克隆的覆盖面达到15个基因组当量. 此外利用了公共数据库中BAC的两端顺序,减少了这部分的测序量. 总的费用实际远超过作图法测序. 4) 鸟枪法并未在真正意义上加速人类基因组计划的进程, 人类基因组测序计划组织在过去7-8年中积累的物理图数据被鸟枪法大量利用是其成功的主要因素之一. 人类基因组草图-2000年版本 1) 人类基因组草图在富含基因的常染色体上约有10%的遗漏，整体而言约有30%遗漏（包括基因匮乏的异染色质区)，忽略或错序的总数