生物物理学-林东海-第五章生物物理技术--等温微量量热法..pptVIP

三. ITC方法的应用 蛋白质-蛋白质相互作用： 抗原-抗体相互作用，分子伴侣-底物相互作用，等等。 蛋白质-小分子相互作用，酶-抑制剂相互作用 蛋白质-核酸相互作用 核酸-核酸相互作用 核酸-小分子相互作用 生物分子-细胞相互作用 DNA/RNA-药物相互作用 酶促反应动力学 蛋白质折叠/去折叠 RNA折叠 1.研究Ras，Cdc42与底物（effector）的结合 Thermodynamics of Ras/Effector and Cdc42/Effector Interactions Probed by Isothermal Titration Calorimetry Herrmann C., J. Biol. Chem. 276: 23914-23921(2001). Ras是一种在信号传导过程中起重要作用的蛋白质，可以向其下游的许多信号传导途径输送细胞内调控信号。Ras在非激活态与GDP结合，当GDP被GTP取代时被激活，与底物（Raf，RalGDS,3-磷脂酰肌醇激酶）发生紧密的结合。 Cdc42是一种GTPase,也是信号传导相关的蛋白，它参与细胞增殖调控和肌动蛋白细胞骨架的调控。CdC42在参与细胞骨架调控的过程中，重要的一步是与WASP蛋白的相互作用。 6 μM 50 μM 6 μM 50 μM Structure and characterization of a noval chicken biotin-binding protein A (BBP-A). Hytonen V.P., et al. BMC Structural Biology, 7:8 (2007). BBP—A是一种类抗生素蛋白（AVD）,具有β折叠的结构，对BTN具有高亲和力，但具有不同于其他抗生素蛋白家族成员的热稳定性和免疫学特性。 BBP—A拥有特异的结合BTN和BSO的配体结合特性，目前作为生物工艺学新材料得到应用。 2. 检测BBP—A和AVD与BTN和BSO结合能力的差异 ITC analysis of bBBP-A and AVD for Binding BTN and BSO: AVD - BTN, AVD – BSO, (c) AVD - D-biotin sulfone, (d) bBBP-A – BTN, (e) bBBP-A – BSO (f) bBBP-A – D-biotin sulfone 3. 其它一些应用例子 蛋白质-蛋白质相互作用 蛋白质-配体相互作用 Wright and Serpersu, Biochemistry,44: 11581-11591 (2005). 妥布霉素是一种对革兰氏阴性菌、多种革兰氏阳性菌有作用的氨基糖苷类抗生素 氨基糖苷核苷转移酶 妥布霉素 蛋白质-配体相互作用 Cooper A, et al., FEBS Lett. 348:41-45(1994). SAM---腺苷甲硫氨酸 Li J. and Weis R. M. (1996) 蛋白质-受体相互作用 三链DNA的形成 Kamiya et al., JACS 118: 4532-4538 （1996）. 多个结合部位 Feng et al., Nat. Struc. Biol., 11:450-454 (2004) Mn2+与核酸酶的结合 寡聚体解离 思考题-16 简述等温微量量热法（ITC）的基本原理和ITC仪的主要构造。 在ITC方法中往往定义C=Ka [M] N （无量纲），简要分析C值对滴定曲线的形状影响。要精确测定蛋白质与配体的结合常数，C可接受的取值范围是多少？最好的取值范围是多少？ 列出ITC谱技术的主要优点和5个主要用途。 §6.6 等温微量量热法 ITC 第五章 生物物理技术 内 容 ITC方法的基本原理 ITC方法的主要优点 ITC方法的主要应用 一. ITC方法的基本原理 生物分子相互作用过程的定量描述 蛋白质P与配体L相互作用（1:1结合）： 当体系达到平衡时，结合平衡常数Ka： Ka倒数为解离平衡常数Kd： Dissociate constant Kd 定量描述蛋白质与配体的相互作用强度（affinity） mM --- 弱作用， μM --- 中等强度作用，nM --- 强作用 分子结合反应是吸热或放热过程 复杂反应过程： 整个反应过程能够自发进行的条件是 △G 0.当△H 0时，说明反应由焓驱动； 当–T△S 0时，说明反应由熵驱动；即△S0,整个反应是个熵增的过程。 量热法（Calorimetry） 在程序控温过程中，测量热量随时间的变化关系 差示扫描量热法(DSC)