生物样品预处理技术..pptVIP

* 示例 仲胺N，显示弱碱性，游离碱难溶于水，易溶于有机溶剂，盐可溶于水 盐酸克仑特罗 (Clenbuterol Hydrochloride)苯乙胺类拟肾上腺素药，β-受体激动剂，用于平喘 * 示例：血浆中盐酸克仑特罗的测定 取血浆0.2ml，加入0.1 mol/l NaOH 50μl，涡旋混匀后加入乙酸乙酯2ml液液萃取，涡旋提取3min，离心，取乙酸乙酯层置于另一干净离心管中，氮气流下50℃水浴挥干，残余物用50μl 流动相溶解后，取10μl 进样LC-MS分析测定。 由于长期用药的不良反应等，SFDA已经于2011年停止生产、销售和使用盐酸克仑特罗片，其他剂型及复方仍可以使用。 * 示例：猪肉中盐酸克仑特罗的测定 盐酸克仑特罗，俗称瘦肉精，具有营养再分配作用，被不法养殖户用作药物促生长添加剂，提高动物的瘦肉率 膳食暴露与食源性疾病 * 示例：猪肉中盐酸克仑特罗的测定 取500g有代表性的猪肉可食部分，用组织捣碎机充分捣碎均匀； 取2g 捣碎样品，加入8ml乙酸钠缓冲液(pH=5.2)，再加入50μlβ-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶溶液，涡旋混合，37℃下避光水浴震荡12h。 样品均匀化 缀合物水解 * 示例：猪肉中盐酸克仑特罗的测定 然后加入0.1mol/l 高氯酸溶液5ml，混匀，用高氯酸调pH至1±0.3，离心取上清液，用氢氧化钠调pH至11，加入10ml乙酸乙酯-异丙醇混合液和10ml饱和氯化钠溶液，震荡10min离心，收集有机相，40℃下水浴氮吹，5ml乙酸钠缓冲液(pH=5.2)溶解，待净化。 调节pH，进行液液萃取 * 示例：猪肉中盐酸克仑特罗的测定 取待净化液过MCX柱(3ml甲醇、3ml水活化，待净化液上样，再依次用3ml水，3ml 2%甲醇-水溶液，3ml甲醇淋洗，5ml 5%氨水甲醇溶液洗脱)，洗脱液在40℃水浴中用氮气吹，浓缩至1ml，再用0.45μm滤膜过滤，即获得样品溶液。 MCX柱—混和弱阳离子交换柱 疏水相互作用+阳离子交换-两种作用使药物保留 固相萃取 * 2g 猪肉 1ml—进样分析 FDA/WHO 0.2μg/kg日本 0.05μg/kg中国 0.1μg/kg FDA/WHO 0.4 ng/ml日本 0.1 ng/ml中国 0.2 ng/ml 方法检测限量 分析对照品的最低定量限 生物样品取样量多少 生物样品前处理方法选择 三、生物样品预处理方法发展 液相微萃取 微滴式 现在常用离子液体为萃取剂，具有粘度大,能悬挂成更大的液滴;且其挥发性小,液滴不易损失 三、生物样品预处理方法发展 液相微萃取 中空纤维式 将多孔性的中空纤维固定在进样器的针头上,用于保护和容纳有机溶剂,同时由于纤维上的多孔性,增加了溶剂与样品接触的表面积,从而提高了萃取率 三、生物样品预处理方法发展 固相微萃取 操作原理与SPE 近似，操作方法迥然不同 SPME 以熔融石英光导纤维或其它材料为基体支持物，采取“相似相溶”的特点，在其表面涂渍不同性质的高分子固定相薄层，通过直接或顶空方式，对待测物进行提取、富集、进样和解析。 SPME 的基本原理和萃取机制可以描述为待测物在介质相和/ 或顶空相、及萃取纤维相的分配平衡过程，在一定条件下达动态平衡时，涂层吸附的待测物的量与样品中的浓度成正比，以此作为定量分析的依据 三、生物样品预处理方法发展 三、生物样品预处理方法发展 三、生物样品预处理方法发展 超滤法 使用一定孔径的滤膜，在高速离心力作用下使分子量小的游离药物随血浆中的水分一道通过滤膜，但滤膜能阻挡住血浆蛋白和与血浆蛋白相结合的药物 测定体内游离药物浓度 测定药时曲线上各点的 血浆蛋白结合率 示例：UF-LC/MS/MS方法的建立 由于超滤有效的除去了血浆蛋白，血浆水样品允许采用直接进样方法，大大简化了样品的处理过程 用于 直 接 进样分析的超滤液由血浆在一定的离心超滤条件下获得，为了与LC/MS分析工作的匹配，滤过液应具备一定量的体积以降低分析对检测灵敏度的严格要求，UF通常更多地在低离心速率(300-3000 g和较长的时间内(15-60 min)完成，延长滤过时间可以提高增加获得的体积，但牺牲了样品的分析效率。 示例：UF-LC/MS/MS方法的建立 不同离心力下，不同离心时间后，超滤液的体积和蛋白含量（样品37℃制备） 13362g，离心3min，大于99%的血浆蛋白被截留，滤液体积满足LC/MS/MS分析要求 示例：UF-LC/MS/MS方法的建立 以上条件下，滤液直接进样对色谱柱柱压的影响较小 示例：UF-LC/MS/MS方法的建立 可能产生的问题： 非特异性结合 药物结构和膜材料的特性决定 解决办法：缩短接触时间