强优势玉米杂交豫玉22雌穗均一化cDNA文库的构建与鉴定.pdf

摘要 本工作通过Trizol Reagent分离了强优势玉米杂交种豫玉22关键发育时期一雌穗分化时期 (生长锥伸长和小穗分化、小花分化、花丝始伸和果穗增K=)一的总RNA，反转录合成cDNA。 构建了均一化eDNA文库，为进一步研究和分离与杂种优势相关的基因构建了技术平台。在雌穗 为187、1．86、1．85和1．99，电泳检测显示】8S、28SrRNA条带清晰，且28S亮度明显大于】8s。 1 分别以Not J酶切，cDNA ％琼脂糖凝胶电泳检测：两条链最长可达5kb。在双链cDNA两段加接头，经过Not 90％、87％、85％和93％，克隆数目分别为：2．7×10’、6．4×104、3．1xlO’和2．1×104，每 kb、1．4kb和13kb。 个独立库随机挑取200个克隆，PCR检测插入片断长度平均为1．2kb、1．3 l、BamHl先后酶切，单酶切后用Klenow 豫玉22基因组DNA分别用EcoR Fragment和 取两份均匀混合的体系先预杂交，接着四个独立cDNA文库各取10ug加入进行杂交。结束后， 洗脱下杂交上的部分，复性转化生成3×104个克隆的均一化cDNA文库。挑取其中200个克隆 检测，插入片断平均大小是1．3kb，其大小分布与独立cDNA文库一样，来发生改变。随机挑取 1 ESTs，11．2％的序列含有两个或两个以上的拷贝， 50个克隆进行测序，81．6％的序列为unique 它们主要来自多基因家族转录本，一定程度上证明了此均一化文库的均一化是有效性。 关键词：cDNA文库，均一化cDNA文库，玉米雌穗分化，RNA提取，eDNA合成 Abstract are the In thetotalRNAsofmaize Y22’earsthat this hybrid duringimportantperiod-ear study isolatedTrizol thecDNA construct synthesis strands，then using Reagent，and developmentperiod-were thenormalizedcDNA isthebasisforthe aboutheterosis．TheRNAratiosof library，which studygenes was1．87、1．86、1．85andl．99 OD260／OD2800ffourperiods thefirststrandcDNAwithNot1 anddoublecDNAstrandswere into primer-adapter synthesizedusing strand method．Theresultsof showedthatthe replacement 1％agrasegel longestsynthasizedfragment be twoendsofthecDNAswere witha withNot could5kb．The