安吉白茶高氨基相关基因分离及鉴定.pdf

摘 要 安吉白茶是在浙江省安吉县海拔800米的高山上发现的自然突变体茶树，其 叶片具有阶段性返白现象。对安吉白茶叶片氨基酸组分及含量进行分析，发现安 吉白茶叶片在阶段性返白过程中，氨基酸含量差异显著，自期总氨基酸含量比绿 期高2．3倍。本研究利用安吉白茶为材料，通过对其返白前后差异表达基因的克 隆分析，试图探明安吉白茶在白化期氨基酸含量呈现明显提高的分子机理。其主 要研究结果如下： 建立了从富含多酚与多糖的茶树叶片中制备高质量总RNA的方法，即在传 统Tri．Reagent法的基础上进行改良，在沉淀RNA时先加入l／2倍体积的高盐， 再加入1／2倍体积的异丙醇，以除去茶多糖的干扰；同时使整个操作过程在低温 环境下迅速连贯的进行，以防止褐化效应并减少RNA酶的污染。利用改良的方 谱带，且前者明显强于后者，表明RNA完整性好，无明显降解现象。 subtractive 应用抑制消减杂交技术(Suppression 白茶白期叶与绿期叶差异表达基因，成功构建了安吉白茶自期叶与绿期叶的正、 反向消减文库。从正反向消减文库中随机挑选160个阳性克隆，通过菌落PCR 和斑点杂交技术进行鉴定，共获得80个差异表达明显的eDNA片段，其大小在 200bp～S00bp之间。 将80个阳性克隆测序，测序结果与GenBank数据库进行比对分析，其结果 表明这些基因片段与光呼吸、能量代谢、蛋白质代谢、胁迫反应、糖代谢等多个 代谢途径相关。其中，1．5基因推测编码的氨基酸序列与拟南芥丝氨酸．乙醛酸转 氨酶的氨基酸序列有83％的相似性。1-9基因推测编码的氨基酸序列与拟南芥丝 氨酸羟甲基转移酶的氨基酸序列有90％的相似性。2．13基因推测编码的氨基酸 序列与钙调热激蛋白具有94％的相似性。 采用荧光定量PCR技术对该3个基因在安吉白茶白期与绿期叶片中的表达 水平进行分析的结果表明，1．5基因和I-9基因在白期叶片中表达水平较绿期高， 2．13基因在绿期叶片中表达水平较白期高。 根据本论文的研究结果，可以初步推测安吉白茶阶段性返白是受钙调热激蛋 白的调控，其茶氨酸与其它氨基酸在白期超常富集的原因可能是丝氨酸．乙醛酸 转氨酶和丝氨酸羟甲基转移酶过表达的结果。每年春茶早期，当环境温度较低时， 钙调热激蛋白基因被抑制表达，而丝氨酸．乙醛酸转氨酶和丝氨酸羟甲基转移酶 基因得以超表达，从而促进了氨基酸及茶氨酸的生物合成，表现出自期叶片中氨 基酸与茶氨酸的水平较高；而在春茶中．后期，随着环境温度的升高，激活了钙 调热激蛋白基因的表达，从而促发了安吉白茶新陈代谢的改变，导致叶绿素生物 合成加快，叶绿素含量上升，表现出叶片由幼嫩时的乳白色向绿色转变，而丝氨 酸-乙醛酸转氨酶和丝氨酸羟甲基转移酶基因表达受到抑制，导致氨基酸与茶氨 酸的生物合成受阻，表现出绿期叶片中氨基酸水平降低。 关键词：安吉白茶；抑制消减杂交；氨基酸；茶氨酸；差异表达基因 lI Abstract Balchaanatural Anji is mutanttea Wasdiseoveredin岫 plant(Camelliasinensis)．It analtitudeof800 at town llighmountain,with meters．10cated of Anji Zhejiang of Balchahas albescent the province．11圮leaf anji stage phenomenon．During albescent contentofaminoacidinwhiteleatiS2-3times thanthat period，the higher in