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注意事项： 本法检测出阳性主要为IgM类RF，阳性血清可连续双倍稀释测效价。每次试验均应设阴、阳性对照。其它见胶乳凝集法注意事项。 第三节???酶联免疫技术及应用 ? 一、酶免疫分析技术 酶免疫分析技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术中使用最广泛的一种方法，具有灵敏度高、特异性强、酶标记物有效期长等优点，现已被广泛应用于医学检验和生物学的各个领域。 （一）原理和分类 酶是催化化学反应的蛋白质，它具有高效性和专一性的特点。酶免疫分析技术是将酶的催化放大作用和抗原抗体反应相结合的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体后，既不影响抗原或抗体免疫反应的特异性，也不改变酶本身的活性。免疫反应进行以后，酶还能催化相应的底物显色，最后利用酶标仪检测颜色的深浅来进行定性或定量分析。显色反应显示酶的存在，表示结合或游离的酶标抗原或抗体的量的变化。 根据反应过程中是否将结合的酶标记物和游离的酶标记物分离，把酶免疫分析技术分为两类：非均相酶免疫测定和均相酶免疫测定。非均相酶免疫测定抗原抗体反应平衡后，将游离的酶标记物和与抗原抗体结合的酶标记物分离开，再通过底物显色进行测定。其代表技术是酶联免疫吸附试验（ELISA）。而均相酶免疫测定由于免疫反应后酶活性的改变，不需将游离的和结合的酶标记物分开。主要用于小分子物质的测定。 （三）常用的标记酶和底物 （1）辣根过氧化物酶（HRP） 其分子量较小，溶解性好，易于提取，来源广泛；酶和酶标记物性质稳定，耐热、耐有机溶剂作用，易于保存，价格低廉；易于标记，标记后活性损失很小。因此HRP是ELISA中应用最广的标记用酶。 HRP底物种类很多，主要有邻苯二胺（OPD）和四甲基联苯胺（TMB），前者由于显色不稳定，对机体有一定致癌性，已逐渐被TMB所替代。 （2）碱性磷酸酶（ALP）和酶底物 （3）β-半乳糖苷酶（β-Gal）和酶底物，常用于均相免疫测定。 （四）固相载体 除均相酶免疫测定外，各种酶免疫测定最后都需要分离结合的酶标记物和游离的酶标记物。固相抗体（抗原）是最有效和简便的分离方法，因此抗体（抗原）固相载体是固相酶免疫测定必不可少的组成成分。 （1）塑料制品： 抗体或蛋白质抗原可通过非共价或物理吸附机制结合到塑料制品表面，材料经济、方法简便，目前，聚苯乙烯微量反应板是ELISA常用的固相载体。 （2）免疫微球 ： 由聚苯乙烯材料制成的塑料微球或颗粒，其直径常为微米或毫米，塑料微球与抗原或抗体偶联后，结合容量大，可以均匀地分散到整个溶液中，极大地增加了反应面积，因此反应速度快，洗涤、分离也方便。 （3）微孔滤膜载体： 是一种多孔性薄膜过滤材料，如醋酸纤维素膜、玻璃纤维素膜和尼龙膜等。广泛应用于定性或半定量斑点ELISA、免疫金标渗滤试验等。 （五）免疫吸附剂 是指于固相载体结合的抗原或抗体。将抗原或抗体固相化的过程称为包被。目前广泛使用的聚苯乙烯固相载体多采用吸附方式包被抗原或抗体。 （4）协同凝集试验：其原理同反向间接凝集试验，但所用的载体是金黄色葡萄球菌，其细胞壁中有A蛋白（SPA），SPA具有能与特异性抗体IgG的Fc段结合的特性。当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体，若与相应抗原接触，就会出现反向间接凝集反应，常用于细菌、病毒、毒素及可溶性抗原的快速检测。 ①间接血凝试验：是以红细胞作为载体的间接凝集试验。可根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱。在临床检测中应用广泛，是经典的抗原抗体反应之一。 ②胶乳凝集试验：是以聚苯乙烯胶乳微粒为载体的间接凝集试验。 ③明胶凝集试验：即以明胶颗粒为载体的间接凝集试验。常用于血清中抗病毒抗体的检测。 间接凝集试验的应用 间接凝集试验具有敏感、快速、操作简便和不需要特殊仪器等优点，既可以检测抗原，又可以检测抗体。已广泛应用于医学检验。特别是对某些疾病的诊断治疗和效果的观察有着重要的参考价值。 （1）抗体的检测 用于检测微生物、寄生虫等感染所产生的抗体及自身抗体和药物抗体。如检测沙门菌抗体和类风湿因子等。 （2）抗原的检测 用于在临床上用反向间接凝集试验检测甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病学调查。在妇产科常用胶乳凝集试验检测孕妇尿中的绒毛膜促性腺激素（HCG）抗原。以诊断早期妊娠。 （二）沉淀反应 沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在适当的条件下发生特异性结合而产生沉淀的现象。沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖等可溶性物质。抗原与相应抗体再介质中或固相表面发生特异性结合，可分为两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异性结合反应，在几秒或几十秒内就可完成，出现可溶性小附和物，十分快速，但肉眼不可见。在免疫比浊法中可以测定免疫复合物形成的速率，称为速率比浊法。第二阶段则