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组织材料 预处理 加冷冻防护剂0℃ 慢冻法-40℃或-100℃ 预冻法-70~-20℃ 快冻法 种质库（-196℃） 迅速解冻（34~40℃） 再培养 细胞生长、植株再生 4、超低温保存的基本方法 4-1、材料选择 茎尖和侧生分生组织 悬浮培养物 原生质体 胚、胚乳、子叶、花粉、花药和种子 愈伤组织 体细胞胚 长期培养的愈伤组织和悬浮细胞在遗传上不稳定，再生植株出现异质性，茎尖培养得到的植株一般与亲本类型相同； 大多数植物的培养细胞不表现全能性，或全能性在长时间培养易丧失；茎尖具有高度的再生能力，且可以获得脱毒植株、进行快繁； 悬浮培养细胞体积较大，并且液泡化程度高，超低温保存后，成活率低。茎尖则相反 多用茎尖、胚，愈伤组织用得少 4-2、预处理 4-2-1、目的 提高细胞分裂与分化的同步化 减少细胞内自由水的含量 增强细胞的抗寒力 使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性 4-2-2、预处理方法 继代培养 预培养 低温锻炼 提高分裂细胞同步化频率，提高细胞超低温保存后的存活频率 预培养基中加入诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂（脱落酸、山梨醇、DMSO） 4-3、冰冻保护剂 4-3-1、作用机理 降低冰点，促进过冷和玻璃态化的形成； 提高细胞内溶液的粘度，减弱结冰过程； 稳定细胞内大分子物质及膜结构，阻止低温伤害； 增加膜物质的透性，在温度降低时，有利于细胞内的水流到细胞外结冰，避免细胞死亡 4-3-2、冰冻保护剂类型 二甲基亚砜（DMSO） 甘油 糖 糖醇 氨基酸 多肽 聚乙二醇（PEG） 4-4、冰冻方法 快速法 慢速法 预冷冻法 干燥冷冻法 4-5、化冻方法 方法：快速解冻，慢速解冻 4-6、再培养 4-7、活力检测 TTC FDA 培养存活率 优越性：1)基于玻璃化的超低温保存不需要昂贵的程序降温仪，比经典法操作简单； 2)由于在冷冻过程中避免了冰晶形成，更适用于茎尖、合子胚等复合器官； 3）适宜于多种外植体材料。 离体保存都基于：保存过程中植物材料在遗传上是相对稳定的，即材料在保存始点和保存终点的遗传组成是一致的。 事实并非如此，因为植物组织培养中会发生体细胞无性系遗传变异。 1）染色体组型的变异； 2）染色体重排造成的基因丢失，或关闭某些显性等位基因（表观遗传变异）； 3）转座子的激活，由转座引起突变； 4）体细胞基因重排； 5）基因的扩增和消解； 6）体细胞姊妹染色单体的互换； 7）潜在病毒的淘汰。 外植体类型：试管苗、愈伤、茎尖。 培养时间 培养条件：激素 形态学； 细胞学； 同工酶； DNA标记：RAPD，AFLP，SSR。 1、长期保存种质的遗传稳定性。 2、长期保存去病毒的种质。 3、保持稀有珍贵及濒危植物的种质资源。 4、保持不稳定性的培养物，如单倍体。 5、保持培养细胞形态发生的能力。 6、防止种质衰老。 7、延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物杂交上的困难。 8、冷冻解冻过程可筛选抗逆新品种。 9、便于国际间的种质交换。 种质离体保存的意义 超低温保存的定义和意义 离体保存的方法 超低温保存的方法 全书 内容 * 常规继代也能保存种质，但会发生染色体结构和数目的变异以及基因突变，产生两个后果：1、导致培养物丧失形态发生能力；2、某些具有特殊产物的细胞系，以及具有某种抗逆性的细胞系在继代培养中丢失重要的性状；3、经常继代，材料面临污染和人为错误而造成种质保存失败的危险。降低生长速度的保存法，虽然能起到一定作用，但不能达到长期保存的目的。研究表明，在-20C时，保存材料易发生变异，在-196C时遗传变异少。 种子只能在一定阶段才有，而营养器官存在时间长，容易获得。只需少量的空间就能保存大量的种质，并且在需要时，可以在实验内快速繁殖。 种质资源离体保存 In vitro conservation of germplasm 一、种质离体保存的意义 种质:指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。 种质保存:利用天然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性、高活力，能通过繁殖将遗传物质传递下去。 一、离体保存种质的意义 1、种质资源的重要性及存在的危机 一、离体保存种质的意义 2、植物种质资源保存方式 异位保存（ex situ conservation） 原位保存（in situ conservation） 种质库 资源圃 种子库 2-1、种植保存 保持母本的优良种性； 直观，尤其对保存材料的表现可以直接了解 占地面积大 受自然灾害影响大 需大量人力、物力和财力 不便于种质资源交换 ----优点 ----不足 2-2、种子保存 优点 占用空间小； 方法简便； 可以多年保存。 局限性 种子生活力随贮藏期延长而逐渐降低、丧失； 无性繁殖植物，难以用此法保存； 种子