烟草DNA的提取与SRAP反应体系的建立.pdfVIP

维普资讯 梁景霞等 烟草 DNA的提取与 SRAP反应体系的建立 33 烟草 DNA的提取与 SRAP反应体系的建立* 梁景霞 祁建 民 吴为人 周东新 陈顺辉 王 涛 陶爱芬 摘 要 以 l0个烟草栽培品种为试验材料 ，研究 了烟草 DNA的提取方法以及对建立烟草 SRAP—PCR反应体系的影 响因子设置梯度实 验 ，筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳 SRAP—PCR反应条件 ：在 25 的反应体 系 中，Mgcl2．0 。l、 dNTP20Ogmol，上下引物各 30ng、DNA模板 40ng、DNA聚合酶 1．5u，扩增程序为 ：在 94~C预变性 5min，反应前 5个循环在 94~Clmin， 33~C1mln，72℃1rain条件下运行 ；随后 的30个循环复性温度提高到53~12，最后72℃延伸 5min。本文还讨论 了不同分子标记在烟草 中 应用 的优缺点以及 SRAP分子标记在烟草上的应用前景，提出了应用 SRAP分子标记构建烟草遗传 图谱 的可行性 。 关键词 ：烟草 DNA提 取 SRAP反应体 系 中图分类号 ：TS41．3 文献标识码 ：A 文章编号 ：1004一s708(200s)04—0033—06 烟草是最早应用于分子生物学和基因工程研究的 双引物设计对基因的ORFs(Openreadingframes)的特定 模式植物之一 ，但其育种的速度却落后于其它作物 ，遗 区域进行扩增 ，上 游引物长 17bp，对外 显子 区域进行 传图谱 的构建至今尚未见报道 。目前我国种植的烟草 特异扩增 。下游引物长 18bp，对 内含子 区域 、启 动子 大部分是国外引进品种…。究其原因除烟草育种 目标 区域进行特异扩增。因不同个体以及物种 的内含子、 固有复杂性与特殊性 以外 ，主要是烟草的育种还依赖 启动子与间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有 于植株的表型选择及一些生理生化指标 的测定 ，未 曾 简便 、高效 、产率高 、高共显性 、重复性好 、易测序、便于 从遗传的层面研究基础应用科学问题 ，使烟草育种 的 克隆 目标片段的特点。目前 已成功地应用于作物遗传 进展受到一定的限制。而在其它作物 中，分子标记辅 多样性分析 [7J、遗传 图谱 的构建_6j_8、重要性状 的标 助选择已体现 了它的优势_2J。目前鉴定烟草种质资源 记_6J以及相关基 因的克隆_9J等方面。 遗传 多样性及 亲缘 关系 的分子标记 主要是采用 由于 SRAP是近年 刚刚发展 的分 子标 记，对它详 RAPD-3 方法 ，RAPD虽然分析程序简便 ，成本较低 ， 细反应体系建立的报道较少 ，而且引物应用于不 同的 但检测的位点不多。已有的分子标记检测表明烟草本 物种反应条件也不 同，因此对 引物的筛选和反应条件 身的遗传基础较为狭窄_3J，因此在烟草分子辅助育种 的优化是非常必要的。本研究以若干栽培品种种质资 中迫切需要寻找能检测遗传相似性或差异性更多的基 源为试验材料 ，旨在探讨烟草 DNA的提取和 SRAP分 因位点数的分子标记方法 ，以加快分子辅助育种 的应 析技术的最佳方案 ，为进一步开展烟草种质资源遗传 用与普及速度。 多样性分析以及遗传连锁图的构建提供科学的依据。 相关序列扩增 多态性 (Sequence—relatedamplified 1 材料与方法 polymorphism，SRAP)[6J是一种新型的基于 PCR的标记 系统 ，