《第一章氨基酸与蛋白质的一级结构》.pptVIP

* 过甲酸氧化法、巯基化合物还原法。 1.几条多肽链借助非共价键连接在一起，可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). 2.几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 二硫键的拆开 * 氨基酸组成分析 常用6 mol/L的盐酸在105-110℃条件下封闭水解24、48和72小时。 优点：不容易引起水解产物的消旋化。 缺点：色氨酸被完全破坏；含有羟基的丝氨酸或苏氨酸等有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。 色氨酸在碱水解中不受破坏 * 胰凝乳蛋白酶或糜蛋白酶：R1=苯丙氨酸Phe、色氨酸Trp、酪氨酸Tyr, R2≠脯氨酸Pro （速度快） 肽链 水解位点 肽链的部分水解 * 胰蛋白酶：R1=赖氨酸Lys 和精氨酸Arg 侧链，R2≠脯氨酸Pro（专一性高）。 CNBr 裂解：Met羧基形成的肽键 肽链 水解位点 * 肽碎片的氨基酸顺序分析 Edman化学降解法：逐个降解 酶降解法：氨肽酶、羧肽酶 质谱法 根据核苷酸序列推定法 * Edman （苯异硫氰酸酯）法：在温和的碱性条件下，苯异硫氰酸酯与肽链N-端的游离α-氨基作用，生成PTC-多肽。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。也可用于肽链N-末端分析。 * 例题 某肽经分析其N-末端和C-末端分别是Ala和Lys，用胰蛋白酶水解产生四个小肽，经Edman法测定，顺序分别为Asp-Phe-Leu-Lys,Met-Phe-Ala-Lys,Ala-Arg,Arg; 用胰凝乳蛋白酶水解产生三个小肽，经Edman法测定顺序分别为Ala-Lys-Asp-Phe,Ala-Arg-Arg-Met-Phe,Leu-Lys。试推断该多肽的一级结构。 * 氨基酸的电泳分离 电泳是指带电颗粒在电场中移动的现象。 氨基酸是两性电解质，在一定pH缓冲液的电场中，氨基酸混合物中各组分根据它们所带净电荷的种类和数量不同，以不同速度向不同方向泳动，从而得以分离。 * 氨基酸的电泳分离 带电颗粒在电场中的泳动速度（电泳迁移率）与分子的净电荷、半径、介质粘度及电压有关。 净电荷可用pI-pH 来近似计算。 可作电泳固相支持物的有滤纸、淀粉、醋酸纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。 * 离子交换层析法分离氨基酸 离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成的不溶性高分子化合物。 阳离子交换树脂含有的酸性基团可解离出Na+ 或H+，当溶液中含有其它阳离子时，它们可以和Na+或H+发生交换而结合在树脂上；同样，阴离子交换树脂含有的碱性基团可解离出OH-，溶液中的阴离子和OH-发生交换而结合在树脂上。 * 分离氨基酸混合物常使用阳离子交换树脂。 交换柱中的树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液上柱，由于各种氨基酸与树脂的亲和力不同，用洗脱液可将各种氨基酸以不同的速度洗脱下来。 在pH3左右, pI10, pI6，pI3的氨基酸混合物的分离情况？ * 氨基酸与树脂间的亲和力，主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用。 在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂间的亲和力次序是碱性氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸。则洗脱顺序是？ * 氨基酸与氨基酸之间通过α-氨基和α-羧基之间失水形成的酰胺键共价的结合在一起，这样形成的化合物称为肽。 在蛋白质化学中，这种酰胺键称为肽键。 2、肽、肽键与肽链 * 由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽，这样就形成了一条线性的链状分子—肽链。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。 * 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。 通常在多肽链的一端含有一个游离的?-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的?-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 生物活性肽。如谷胱甘肽,其重要生理功能有清除有害的氧化剂、作为植物体内的电子传递体等。此外，许多重要的激素如舒缓激肽、脑啡肽，某些抗菌素如短杆菌肽S也是重要的生物活性肽。 * * 3、蛋白质的分离与鉴定 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 (1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； (2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。 (3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。 * 前处理：(1)破碎生物组织。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。 (2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽