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研究报告中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(2):1～7 小鼠新分泌蛋白基因mBolA1的克隆与鉴定* 曹家兵1,2周宇波2祁佳1,2杨鸿蒙2王克生2韩泽广1,2** (1 华东理工大学生物工程学院生物化学系上海200237) (2 国家人类基因组南方研究中心上海201203) 摘要采用生物信息学工具预测与实验相结合的方法得到了一个新的小鼠分泌蛋白基因mBolA1。该基因定位于染色体3F2，cDNA全长为730bp，编码137个氨基酸的蛋白，该蛋白含有一个保守的BolA结构域，等电点为9.05。用RTPCR方法从鼠的混合cDNA库中克隆到mBolA1。Western blot实验表明mBolA1能从瞬转的COS7细胞中分泌到细胞培养液中。亚细胞定位显示mBolA1定位于细胞浆，且与高尔基体不共定位，提示它是个非经典分泌途径的分泌蛋白。RTPCR显示mBolA1在组织中广泛表达。它的具体功能有待进一步研究。 关键词分泌蛋白mBolA1非经典分泌Western blot亚细胞定位RTPCR 中图分类号Q785 收稿日期：20051025修回日期：20051222 * 国家“863”计划资助项目（2002BA711A2002） ** 通讯作者，电子信箱：hanzg@分泌蛋白是一类功能非常重要的蛋白，在多细胞生物的生长、发育、细胞分化、增殖、凋亡、细胞通讯、信号传导中发挥着重要作用［1］。人体中分泌蛋白占人类蛋白质组的十分之一［2］。在人体中,分泌蛋白参与了信号通路、免疫反应、血凝、抗血凝以及肿瘤的发生等多种过程；人体内的许多细胞因子、激素、神经肽以及血浆中的许多蛋白都是分泌蛋白。从药物治疗的角度来看，分泌蛋白占据了蛋白药物的绝大部分，例如一些组织特异的纤溶酶原激活因子、红细胞生成素、蛋白激素和消化酶等［3］。这些蛋白药物在激素调节、疼痛减轻、血液凝固、免疫反应、癌症发生、血管生成等许多领域有重要意义。一些分泌蛋白如生长激素、干扰素和白细胞介素已经在临床上得到了广泛的应用［2］。 一般情况下，分泌蛋白是由信号肽（signal peptide）介导，进入内质网，通过高尔基体进一步经过各种类型的翻译后加工，包括肽链的折叠、一些残基的修饰（例如糖基化等）、前体的激活等，成为有特定结构和功能的蛋白质，然后分泌到细胞外。这样的分泌途径被称为经典的蛋白质分泌途径［4］。近年来发现细胞内存在另一类分泌蛋白,它们能够分泌到细胞外发挥功能,但却没有典型的信号肽序列,被称为非经典分泌蛋白［5］。现阶段有实验手段证明的非经典分泌蛋白还是比较有限的，只有：白细胞介素1β（Interleukin1β）［6］，半乳糖苷凝集素1（Galectin1）［7］等少数几种。这类蛋白在生物体内发挥着重要功能,它们常与细胞增殖、免疫反应、肿瘤形成、感染病理学等过程密切相关。 我们实验室利用生物信息学,通过大规模的信号肽分析筛选,得到了很多分泌蛋白基因,这些基因很多是功能未知的。我们筛选到了小鼠的BolA1基因，它没有信号肽，验证了小鼠BolA1蛋白的分泌性及分泌途径，并对BolA蛋白家族蛋白的功能进行初步探讨。 1材料和方法1.1生物信息学分析 网上共享web软件SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP2.0/分析信号肽；SOSUI teome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe 0.html预测穿膜区域及疏水性；PSORT http://psort.nibb.ac.jp/进行亚细胞定位分析［1,8］。综合以上分析结果，筛选出用于试验验证的候选基因。 1.2cDNA克隆与表达载体构建 以鼠的9种组织:心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脑、小肠和卵巢的混合cDNA为模板进行PCR，设计mBolA1全长基因读码框架两端的引物FP：GCGGATCCATGCTAAGTGCGCGAT，含BamHI酶切位点，RP：GCAAGCTTAGAGGTCCCTCGAGTTTTC，含HindIII酶切位点；PCR条件：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸50s，共35循环；72℃延伸7min。将PCR产物装入pcDNA3.1MycHisA（）载体（Invitrogen），该载体含有新霉素抗性基因和氨苄抗性基因，人巨细胞病毒早期启动子，在多克隆位点后面有cmyc表位（GluGlnLysLeuIleSerGluGluAspLeu）和C端多组氨酸标签（6×His）。pcDNA3.1质粒可在大肠杆菌中扩增，抽质粒测序验证插入片段的序列和读码框架的正确性。 1.3mBolA1基因组结构和蛋白序列分析 对非冗余库BLAST