RTPCR的原理和操作.pdf

Real-time PCR 概論 Introduction 自從聚合酶連鎖反應( PCR)技術開發至今 ，幾乎是分子生物學中最被 普遍使用的技術。PCR 主要是運用 DNA 的變性、黏合及延伸等三步驟的循環， 連續擴增目標DNA 片段。在人類的疾病或其他動植物的疫病蟲害檢測上，以PCR 為基礎的技術都被廣泛的應用，例如多重聚合酶連鎖反應(Multiplex PCR) 、巢 式聚合酶連鎖反應(Nested PCR) 、逢機增幅多態型-聚合酶連鎖反應 (RAPD-PCR) 、序列特徵化增幅區域(SCARs) 、聚合酶連鎖反應限制性片段長度- 多態性(PCR-RFLP)以及即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)等。其中以 Real-time PCR 近年被使用的頻率逐漸被提高，除了反應時間大量的縮短之外， 儀器及技術亦不斷的創新進步，真正可以做到兼顧到準確度、敏感度及高效率的 多項優點。 What is Real-time PCR Real-time PCR ，顧名思義可以視為兩個部份，”Real-time”和 PCR 。藉 由 PCR 擴增的原理，使極微量的 DNA 放大，再經由光學系統達到即時偵測 (Real-time)的效果。每一次 PCR 擴增循環後，將其生成反應產物之數量記錄下 來，待反應全部完成之後，以 cycle number 和生成產物做圖，可得到一反應曲 線圖形，完整的呈現 PCR 反應中每一個 cycle 產物的生成情形 ，所以稱為即時 定量 PCR 。 PCR vs. Real-time PCR 一般的 PCR 反應，利用熱循環步驟，使目標基因以 2n 進行擴增，將微量的 DNA 目標片段放大。最後，再利用洋菜膠電泳(agarose gel electrophoresis) 進行結果分析。我們可以經由產物的片段大小、擴增後產物生成量等等條件來判 斷實驗結果是否成功。必須等反應結束後再進行洋菜膠體電泳分析，對於反應過 程並沒有做任何分析、記錄，故一般 PCR 反應又可稱為 End-point PCR 。 PCR vs. Real-time PCR 一般的 PCR 反應 ，利用熱循環步驟 ，使目標基因以 2n 進行擴增 ，將微量的 DNA 目標片段放大。最後，再利用洋菜膠電泳(agarose gel electrophoresis) 進行結果分析。我們可以經由產物的片段大小、擴增後產物生成量等等條件來判 斷實驗結果是否成功。必須等反應結束後再進行洋菜膠體電泳分析，對於反應過 程並沒有做任何分析、記錄，故一般 PCR 反應又可稱為 End-point PCR 。 Real-time PCR 和傳統PCR 一樣是利用熱循環步驟使微量DNA 樣本進行擴 增 ，達到放大的目的。但是最後並不是以洋菜膠電泳進行結果判讀。而是經由 光學系統去偵測反應中產物量( 螢光物質) 的變化而反應在電腦上 ， Real-time PCR 會紀錄每一個 PCR cycle 產物生成的情形，藉由分析 PCR cycle 與生成產物這兩個因素之間的相對關係 ，來進行實驗結果的判讀。所以， Real-time PCR 相較於 End-point PCR ，較重視 DNA 樣本進行擴增的過程 ，而 非擴增後生成的產物。Real-time PCR 的配備主要有 PCR 機器、光學系 統及電腦。隨著技術的改良進步，Real-time PCR 在精確度及敏感度 都優於傳統 PCR 。目前Real-time PCR 螢光系統可大致分為「非探 針型」及「探針型」。 Real-time PCR 的優缺點 Real-time PCR 的優點就實驗時間可以大幅縮短，也可在電腦上 即時監測實驗結果，且鑑定的專一性、敏感度及準確度也較一般 PCR 方式為高。檢測過程不用進行洋菜膠體電泳分析，除了可以節省時間 及洋菜膠的材料費外，也可避免多做這個實驗所造成的污染及操作誤 差。此外，不論使用探針或非探針的方法，Real-time PCR 皆可精準 定量，確定目標 DNA 的初始濃度，這對於植物防檢疫中的抗病育種 及輸入農產品檢測方面，特別具有意義。而傳統 PCR 僅能用於定性 分析，至多能達到「半定量(semi -quantitative) 的程度。甚至已有廠 商開發出手提式的 Real-time PCR 機器，可在野外或田間都使用直接 進行檢測。而 Real-time PCR 的缺點則是機器及反應耗材的費用相對 較高，