重组T质粒的构建.pdfVIP

中国试剂网 3.13.3.14 重组T 质粒的构建 一．原理 外源DNA 与载体分子的连接就是DNA 重组，这样重新组合的DNA 叫做重组体 或重组子。重组的DNA 分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2 、ATP 存在的 连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA 分子进行连接。DNA 连 接酶有两种：T4 噬菌体DNA 连接酶和大肠杆菌DNA 连接酶。两种DNA 连接 酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA 分子连在一起的功能，而且T4 噬菌体 DNA 连接酶还有一种大肠杆菌DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双 链DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过 提高T4 噬菌体DNA 连接酶浓度或增加DNA 浓度来提高平末端的连接效率。T4 噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅 因子ATP 形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP 复合物再结合到具有5 ’磷酸基和 3 ’羟基切口的DNA 上，使DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切 口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA 片断有两个端 点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方 法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同， 连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环 的高本底，可对载体进行5 ’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA 片断的 3 ’OH 末端与5 ’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外 源片断提供5 ’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自 环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端， 这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个 特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在 37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢 键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即 12-16℃，连接 12-16h （过夜）， 这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA 酶扩增的PCR 产物，其DNA 双链前后末端都有一个游离的A 碱基，可以 与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T 碱基互补形成环状重组T 质粒。 二．材料与方法 中国试剂网 3.13.3.14 1 材料 外源DNA 片断 2 仪器、用具 移液枪、碎冰 3 试剂 pMD 18-T Vector ；Ligation buffer ；T4 ligatease ；rATP 4 方法 连接体系如下： 16℃连接过夜。