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第36卷 HUAXUE)研究简报 第5期 分析化学(FENXI of 695～698 2008年5月 ChineseJ如malAnalyticalChemistry pH控制相转变分离-荧光免疫分析嗜水气单胞菌外膜蛋白 林鹏 冯建军 邹志华 王淑红 杨铅 王艺磊’ (集美大学水产学院，水产科学技术与食品安全省高校重点实验室，厦门361021) membrane 摘要以pH敏感高分子作为载体，建立了荧光免疫分析嗜水气单胞菌外膜蛋白(outer protein， 与固定在高分子上的抗体在37℃均相反应，然后进一步与异硫氰酸荧光素标记抗体均相反应，调整pH分离 出高分子免疫复合物沉淀，重新溶解后根据荧光强度确定OMP浓度。OMP在0．4～30mg／L范围内与体系 相对荧光强度呈良好线性关系，检出限为31t培,／L。方法灵敏、快速且操作简便，抗体通过EDCI活化的羧基 与氨基反应固定到高分子上，固定化效率、固定抗体的免疫反应活性较之以前的固定方法均得到了提高。 关键词免疫分析，氢离子敏感相，分离，嗜水气单胞菌，外膜蛋白 1 引 言 J，以此高分子为载体的 氢离子敏感高分子因其独特的pH敏感性质而在免疫分析中得到应用【l，2 pH敏感相分离免疫分析由于采用均相免疫反应和异相分离，克服了均相和异相两种免疫分析模式的局 限性，与温度敏感高分子相比【3J，又可以在37℃进行免疫反应，提高了反应速度和效率。抗体(或抗 原)在高分子上的固定是免疫分析的关键步骤，目前固定的方法主要是通过先与』v一羟基琥珀酰亚胺丙 烯酸酯(N-hydroxysuccinimidyl 在使得共聚产生的高分子pH敏感性质受到影响。此外，自由基引发过程对抗体(或抗原)造成损害，高 分子在生物活性物质表面的缠绕造成抗体(或抗原)免疫活性的降低，固定化效率不高。本研究组【4】曾 采用先将NAS与单体热引发共聚再偶联抗体(或抗原)的方法对固定方式进行了改进，可部分克服上述 缺点，但NAS对pH敏感性质的影响仍不能消除。本研究探讨了抗体在高分子上的新型固定化方式，通 子本身所带羧基，然后与抗体氨基相连，这种固定化方式由于没有引入NAS，对pH敏感性能的影响可 以完全消除，同时固定化效率及固定抗体的免疫反应活性较之以前的固定方式均有较大提高。 嗜水气单胞菌是引起鱼类暴发性流行病的重要病原菌，能够引起鱼类等多种动物的败血症[5]，给 membrane 水产养殖业造成极大损失，外膜蛋白(outer protein，OMP)作为细菌表面主要抗原物质，具有型 和种的特异性，已广泛用于细菌感染的血清学诊断∞J，因此，OMP的分析检测对于预防鱼类败血症暴发 分析，大大缩短了分析时间，灵敏度与ELISA法相当。 2 实验部分 2．1仪器和试剂 Cary 2007-11-22收稿；2008-01—16接受 2007StaY2)资助项目 ·E—mail：yt,,,m归jm．edu．∞ 万方数据万方数据 分析化学 第36卷 氮二异丁腈(2，2 据文献[10]制备，标记比为1；磷酸盐缓冲溶液；Na：CO，．NaHCO，缓冲溶液；HAc—NaAe缓冲溶液。 2．2实验方法 2．2．1 1 mol／L N·异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸共聚物[P(NIP．MAA)]的合成取975斗L NIP与 0．1mol／L