液相色谱的方法开发_分离机理及色谱柱.ppt

液相色谱的方法开发 分离机理及色谱柱 选HPLC参数时的基本考虑 溶解度 - 选择流动相的条件 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 官能团 - 有否离子化基团? 保留特性如何? 样品的基质 - 考虑如何前处理 样品在基质中的含量- 分析、制备都需考虑 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? 找出样品中不同组份之间的差异 摸索条件的重要线索 极性问题 液相色谱的分离机理 正相 反相 体积排除 离子交换 其他 不同的分离模式基于不同的机理 吸附色谱的分离机理 吸附色谱概述 分离基于样品的极性差异。 洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱 常用的流动相∶ 非极性有机溶剂，如己烷 乙酸等为添加剂 常用固定相∶ 硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。 分配色谱的分离机理 分配色谱概述 反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即：极性高的先被洗脱 常用的流动相： 水和有机溶剂如甲醇、乙腈 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、氨基等基团 反相色谱固定相多为键合相 键合相色谱柱 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点∶ 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点∶ pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同 体积排除色谱的分离机理 凝胶色谱概述 凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC） 分离基于分子在溶液中的体积大小 洗脱次序：大分子先被洗脱 流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测 GPC的校正 离子交换树脂的分离机理 离子交换色谱概述 适用于离子型化合物的分离 分离基于离子的带电特性 洗脱次序受多种因素的影响 填料（离子交换树脂）的种类∶阴/阳，强/弱，交换基团 样品分子特性 盐的种类、浓度 温度及pH值 有机溶剂 离子交换树脂的交换容量 液相色谱柱与分离机理的关系 从色谱方法上分 正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合 疏水回受 从柱子类型上分 分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合 色谱柱化学及外形结构的关系 色谱柱的规格 内径 检测的灵敏度 样品的容量 长度 分离度，理论塔板数 速度 样品的容量 检测的灵敏度 对HPLC柱的了解 平均颗粒度，颗粒度分布 颗粒度(dp) 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差) 颗粒分布 颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差) 颗粒形状 球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展 对HPLC柱的了解（二） 平均孔径/孔体积 孔径/孔体积分布 大的孔径可分析高分子量的分子 对HPLC柱的了解（三） 键合相化学 影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN 对HPLC柱的了解（四） 含碳量 含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加） 高含碳量 有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善 低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗 不同色谱柱的含碳量 色谱柱 C% k苊 (50/50的乙腈/水) Symmetry C18 19 17 Zorbax ODS 17 15.7 LiChrosorb RP-18 15 10.3 Symmetry C8 12 12.5 Resolve C-18 12 12.4 Ultrasphere ODS 11 11.3 Partisil ODS-3 11 12.0 mBondpak C-18 10 7.9 Nova-Pak C-18 7 5.5 对HPLC柱的了解(五) 填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%） 残基处理的效果 对HPLC柱的了解（六） 硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为：k 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志 对HPLC柱的了解（七） 填料的稳定性 硅胶填料 pH：2-8 聚合物填料 pH：2-12 pH值小于2时键合相水解 Waters各种硅胶基质的色谱柱 Waters不同品牌的色谱柱 m-BondaPak 文献背景强, 是工业标准 平均孔径125?，10mm高活性、无定形硅胶 中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性 Nova-Pak 平均孔径60?，4mm高韧度低活性球形