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医学类研究生实验技术讲义 江苏大学基础医学与医学技术学院 编 2009年10月 第一章 细胞学实验技术 实验一 正常细胞与肿瘤细胞常规染色体的标本制备 【实验目的】 掌握微量全血培养及正常细胞和肿瘤细胞常规核型的标本制备技术。了解正常及肿瘤细胞核型的一般特征。 【实验用品】 一、材料和标本 健康人的外周血、培养的 HeLa 细胞和 HL—60 细胞。 二、器材和仪器 超净台、酒精灯、乳胶管、火柴、镊子、废液缸、离心机、水浴箱、定时钟、天平、离心管(10m1)、乳头吸管、显微镜、载玻片、平皿等。无菌器材有培养瓶、培养皿、注射器(5ml、lml)、注射针头(7 号、6 号)、刻度移液管(5ml、2ml、lml)、吸管等。 三、试剂 1640 培养液、500 单位／ml 的肝素溶液、10μg／ml 的秋水仙素溶液、0.25％胰蛋白酶一 0.02％EDTA 混合消化液,O．5mg／ml 的 PHA 溶液、0.075mol／L 的 KCl 溶液，甲醇、冰醋酸、Giemsa 原液、磷酸缓冲液(pH6.8)、生理盐水等。 【实验内容】 一、微量全血培养 (一)原理 人体外周血中淋巴细胞是成熟的免疫细胞， 正常情况下处于G0期不再增殖。PHA(Phytohemagglutinin，植物血凝素)是人和其它动物淋巴细胞的有丝分裂刺激剂，它能使处于G0 期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进入细胞周期开始旺盛的有丝分裂。人体微量全血培养是一种简单的淋巴细胞培养方法。此法采血量少、操作简便，在 PHA 作用下进行短期培养即可获丰富的、有丝分裂活跃的淋巴母细胞，适于制备核型标本。各种因素的效应(如病毒、电离辐射、化学药剂等)也可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而进行多种在体内无法进行的研究。因此它是细胞生物学及其它学科研究中的一种有效的方法。 (二)操作 1．打开超净台紫外灯 20～30 分钟。洗手、换洁净白大衣后进入操作室。启动超净台，点燃酒精灯。用 75％酒精棉球擦洗手、各种试剂瓶及操作台面，然后将培养液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超净台。 2．在超净台内将每个培养瓶装入 5ml 培养液及 0.2ml PHA 溶液，封好备用。 3．用 5ml 注射器，7 号针头，先吸取少许肝素湿润针筒，然后从肘静脉抽血 l～2ml。 每个培养瓶接种全血 O.2ml 左右轻轻摇动使血和培养液混匀。 4．在培养瓶上标记好供血者姓名、性别、采血日期等，放入培养箱中 37℃培养。每天轻轻震荡培养瓶二、三次，防止血球沉积并保证血细胞与培养液充分接触，促进细胞生长繁殖。 二、人淋巴细胞染色体标本制备 (一)原理 在淋巴母细胞分裂高峰时加入秋水仙素，破坏细胞纺锤体的形成，使细胞停止在分裂中期。然后收集细胞，低渗处理，使细胞胀大，染色体伸展。接着进行固定并除去中期分裂相中残存的蛋白质，使染色体清晰且分散良好。再结合离心技术去掉红细胞碎片，然后采用空气干燥法制片获得中期染色体标本。 (二)操作 1．微量全血细胞培养至 68 小时左右，用 1ml 注射器 6号针头向每个 5ml 培养瓶内加 2 滴秋水仙素溶液，摇匀后继续培养 3 小时，此项操作不需要严格无菌。 2．按时终止培养，用吸管温和吹打成细胞悬液后，移至10ml 离心管中。用 天平平衡后以1000rpm离心 8 分钟，弃大部上清，剩 0.5ml。再吹打成细胞悬液，加入预热 37℃的 0.075mol／L 的 KCL溶液 9ml，置 37℃水浴中低渗处理 30 分钟(这期间配制 3:1 甲醇一冰醋酸固定液)。 3.向离心管中加入 1ml 固定液预固定。平衡后以1000rpm 离心 8 分钟，同样剩 0.5ml 上清。 4．轻轻将细胞吹成悬液，加 5-6ml 固定液，室温下固定 30 分钟。然后离心，弃上清，重复固定一次。再离心，留 0.1～0.2ml 上清，吹打成细胞悬液。 5．吸取 1～2 滴悬液，在距载玻片约 15cm 高度滴于预冷的干净载玻片上，迅速对准细胞吹气促进染色体分散。斜放载玻片，在空气中晾干(此期间配制 Giemsa 染液，Giemsa 原液和磷酸缓冲液1:10)。 6．将标本面朝下放在染色槽中，加入染液染 10 分钟，自来水冲洗，晾干后观察。 (三)结果 低倍镜下，制片质量较好的标本上可看到有较多的分裂相，染色体之间分散良好，互不重叠。油镜下观察可见每一条染色体都含有两条染色单体，两条单体由着丝粒相结。分区计数染色体数目并判定性别，或拍照后进行核型分析。 三、肿瘤细胞的染色体标本制备 (一)原理 利用肿瘤细胞无限繁殖的特点，掌握其体外生长动态，取处于对数生长期的细胞便可获得丰富的分裂相。肿瘤细胞染色体异常包括两个方面： 1．结构异常 即在肿瘤细胞常出现的染色体畸变，包括双着丝点染色体、环状染色体、断裂的