色谱2-HPLC.ppt

第三章 高效液相色谱法 样品溶液的稳定性 有些样品在流动相条件下不稳定，放置后会产生杂质峰，应注意。 例如有一样品在流动相溶液中不稳定，配制后于不同时间进样，发现在主峰后会产生一杂质峰，该杂峰随时间而迅速增大。 将流动相中缓冲液换成水后，样品测定液放置15h后仍稳定。 上述情况说明流动相pH对弱酸、弱碱性物质色谱行为的影响。 一般情况下被测物呈分子状态保留时间长，而成盐状态时保留时间短。 但碱性物质还可被固定相中未硅烷化的硅羟基吸附而导致拖尾或保留时间长。 离子对色谱 （paired ion chromatography） 原理：将平衡离子（反离子）加入到流动相中，在一定pH 条件下，与呈解离状态的药物作用，生成脂溶性的中性离子对结合物，从而增加了被测物在固定相上的保留，改善分离效果。 分离机制 离子对模型 动态离子交换作用 离子相互作用 I- (m) + D+(m) 离子对模型 固 定 相 （s） 流动相（m） DI（m） DI（s） 疏水作用 反离子 药物离子 离子对 动态离子交换作用 固 定 相 （s） 流动相（m） I (m) D(m) I（s） I（s） 离子交换 反离子 药物 离子相互作用 固 定 相 （s） 流动相（m） I (m) D(m) I(s) I (s)D D(s) 静电作用 非静电作用 药物 反离子 动态双电层 影响离子对色谱的主要因素: 反离子的种类 离子对试剂的链长 有机改性剂 流动相pH值 碱性药物——烷基磺酸盐 酸性药物——季胺盐 烷基碳链长, 被测物保留时间长； 离子对试剂浓度增大(一定范围内)， 被测物保留时间增加。 流动相中 甲醇 、 乙腈等浓度增加， 被测物保留值降低。 流动相pH值对离子对形成甚为重要， 同时还应考虑柱填料对酸碱的承受能力， 一般在 pH2—8范围内调整，使用缓冲液。 九取代; 十取代 例：十取代芦丁硫酸钠的结构 色谱柱和离子对试剂的选择 RDS为极性化合物，在不加离子对试剂的情况下分别选用不同极性的色谱柱进行了考察，C18柱、C8柱、C3柱、C1柱、Ph柱、SB-Aq柱、NH2柱（正、反相）和CN柱（正相）等； 离子对试剂：四甲基溴化铵（TMAB）、四乙基氯化铵（TEAC）和四丁基溴化铵（TBAB）。 离子对试剂浓度的选择 2.7 2.7 2.7 2.6 — — 分离度 （R） 2700 2700 2600 2400 N 9.14 10.15 12.15 21.02 无 保留 无 保留 tR (min) 九取代 3600 3700 3200 2100 N 7.46 8.32 9.94 17.25 无 保留 无 保留 tR (min) 十取代 30 25 20 15 10 5 离子对浓度mmol/L 流动相pH值的选择 2.4 2.4 2.3 2.2 2.2 1.7 分离度 R 2500 2500 2400 2400 2100 1700 N 5.72 6.84 9.20 10.25 12.09 19.46 tR (min) 九取代 3700 3700 3300 3200 2800 2700 N 4.92 5.82 7.73 8.62 10.12 16.81 tR (min) 十取代 8.0 7.5 6.8 6.0 5.2 4.4 pH 流动相离子强度（缓冲液浓度）的选择 2.6 2.6 2.5 1.8 分离度 R 2900 2900 2900 2600 N 9.73 12.00 19.83 53.52 tR (min) 九取代 3100 3100 3200 3100 N 7.58 9.86 17.06 47.42 tR (min) 十取代 20 15 10 5 Conc. ( mmol·L-1) 色谱条件：XDB-C8柱（Agilent，150 × 4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈：25 mmol/LTBAB缓冲液（KH2PO4 10 mmol/L， TEA调节pH 7.5）= 48:52，流速：1.0 mL/min，检测波长：λ = 254 nm；柱温：25 ℃，进样量：20 μL。 十取代 九取代 离子对色谱适用范围 有机酸（弱酸、强酸） 有机碱（弱碱、强碱） 有机酸、碱类混合物 两性药物 解离与非解离药物的混合物 控制pH : 使其中一类药物电离， 另一类药物呈非解离型。 调节流动相组成，使非解离物有合适tR，再在流动相中加反离子，与解离态药物形成离子对。 离子对色谱与离子抑制色谱的区别： 离子对色谱与离子（交换）色谱的区别。 注意 适用不同强度的酸、碱、两性物、酸碱混合物。 适用弱酸、弱碱。 分析 对象 流动相中加入反离子