第六章体外.pptVIP

第 六 章 体外分析技术 现代医学的发展疾病诊断的革新 可在没有任何临床症状，而病人体内发生 1. 基因表达异常； 2. 受体分布异常或受体功能改变； 3. 器官代谢异常； 4. 激素水平异常 酶、神经递质 ……等异常， 可早期发现。 体外分析和影像学的发展起了很大作用 例如 癌症的早期诊断 放射免疫分析法的创立集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫发应的高特异性 1959 美国Yalow Berson 1960 英国 Ekim’s 1977 获诺贝尔医学生物学奖 R：放射性核素标记抗原 高灵敏（10 -9~ -15 g/ml） 探测待测物上的标记信号 (标记物的放大效应) 定义 以放射核素标记（或其他非放射性标记）的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。 体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。 方法学基础 结合反应 遵守可逆反应的质量作用定律： k1, v1 [R]+[L] [RL] k2, v2 定量手段 放射性测量技术 酶定量技术 化学发光定量技术 生物学基础 特异性结合反应： 抗原-抗体的免疫结合反应； 配基-受体的结合反应； 底物-催化酶之间的酶促反应； 结合体对： 抗原--抗体 激素--激素结合球蛋白 受体--配体 第 一 节 放射免疫分析 (Radioimmunoassay) 一、基本原理 在实际的操作中，我们一般要设立以下几个反应管： 1．最大结合管（Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。 2．非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。 3．总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总放射性。 4．标准管（B1~Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为B。 5．样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。 常用的有B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B等这些反应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化的函数关系。 标准曲线左：横座标为等份刻度；　右：横座标为对数刻度 操作基本步骤 1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。 2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37℃。 3.分离：选择好的分离方法分离游离抗原和抗原－抗体复合物。 4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。 5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。 二、基本方法 ㈠ 基本试剂 二、基本方法 ㈡ B和F的分离 分离方法的要求 分离完全、快速。 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 受环境因素（温度、PH值等）的影响小。 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。 三、质量控制（quality control） 1、精密度（precision） 变异系数（ CV ）7%~10% 质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。 具体作用有： 1．检查误差的程度，决定测定结果的取舍。 2．识别误差的来源并消除其原因。 3．改进测定方法的设计以提高质量。 RIA 小 结 灵敏度高 特异性好 精确的定量 方法操作简便 第二节 免疫放射分析法 非放射性标记免疫分析技术 一、酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。