生物大实验（酶工程实验）.docVIP

实验一 酶促反应中初速度时间范围测定 一、实验目的 1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理； 2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。 二、实验原理 酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。 酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。 利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。 酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。 要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。 三、实验试剂与器材 1.试剂 （1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取） （2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到） 取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6～0.7之间。 （3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯 精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。 （4）0.3mol/LNaOH溶液 2．器材 恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。 四、操作步骤 1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备 称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。 2.酶促反应 取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min。然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH终止反应。冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A405值。 3.数据处理 以反应时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中直线部分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。 表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 NPP（mL） 稀释酶液(mL) 反应时间（min） 0．3M NaOH(mL) 1.0 1.0 3 3.0 1.0 1.0 5 3.0 1.0 1.0 7 3.0 1.0 1.0 10 3.0 1.0 1.0 12 3.0 1.0 1.0 15 3.0 1.0 1.0 20 3.0 1.0 1.0 25 3.0 1.0 1.0 30 3.0 1.0 1.0 40 3.0 1.0 1.0 50 3.0 1.0 1.0 25 3.0 五、实验报告 绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。 实验二 过氧化氢酶米氏常数的测定 目的 了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。 实验原理 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。 本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν-1/[S]作图求Km 实验器材 锥形瓶100～150ml（×6）。 吸管1.0