121蛋白质的分离纯化.pptVIP

基因工程下游技术简介 下游工艺的大体步骤 细胞扩增 细胞破碎 离心分离 （溶解包涵体） 层析分离 （离子交换层析 反相层析 疏水层析 凝胶层析 亲和层析等） 分离纯化的要求 1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白质的一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求保持天然构象状态，有高度的生物活 性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。 细胞破碎方法 1. 机械法： 1) 研磨：将样品置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将细胞打碎。 2.物理法： 1) 反复冻融法：将细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。 细胞器的分离 细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网等，植物细胞还有叶绿体。 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。 细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。 粗分级分离 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开。 优点：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质。 缺点：分辨率低，产品杂质多 1. 盐析（中性盐沉淀） 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。 盐析法多用于蛋白质分离， 已有八十多年的历史，其突出的优点是： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。 ⑴ 盐析的基本原理 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素为：水化膜和电荷。 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子聚集形成沉淀。 Salting-in 蛋白质聚集沉淀 ⑵ 中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到， 硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类： 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水） 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类： 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜，废液不污染环境。 （3）分段盐析 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。 （