微生物与发酵工程实验讲义.docVIP

微生物与发酵工程实验 济南大学化学与化工学院生物技术系 2007年6月 实验一 细菌生长曲线的测定 目的要求 了解比光电比浊计数法原理 学习掌握光电比浊计数法的操作方法 通过细菌光密度的测量，了解细菌生长特征和规律，绘制生长曲线 基本原理 当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的通过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池准确测出。测定细菌浊度，光波通常选择400~700nm。光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。 大多数细菌的繁殖速度很快。将一定的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数生长期、稳定期/衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同培养条件下所绘制的生长曲线也不同。测定细菌的生长曲线，了解其生长规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。 试剂和仪器 菌种：放射状土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter) 培养基： 蔗糖 2%，酵母膏 0.05%, 尿素0.05%, NaCl 0.01%, K2HPO4 0.5%，(NH4)2SO4 0.02%，MgSO4?7H2O 0.02%, pH 7.0 仪器及其他用具 755型分光光度计，振荡摇床，无菌吸管等。 实验步骤 接种 用接种环接种一环细菌到盛有6ml液体培养基的试管中，30℃120rpm摇床振荡过夜培养。 转接及取样 将上述培养液接种到盛有54ml液体培养基的三角瓶内，30℃120rpm摇床振荡培养，每隔2小时用无菌吸管取样3ml测定比浊。 OD600测定 用未接种的液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。（注：这里以水为对照，测定空白培养基的OD值，最后把这个差减去即可。） 4．结果分析及讨论 实验结果 将测定的OD600填入下表： 培养时间（hr） 对照 0 2 4 6 8 10 12 光密度（OD600） 绘制土壤杆菌的生长曲线 以培养时间为横坐标，以OD600为纵坐标作图绘制土壤杆菌的生长曲线，找出生长时间及生长量的关系，区分土壤杆菌的延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期。 思考题： 1. 光电比浊计数的原理是什么？ 2. 如何区分土壤杆菌的延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期，并说出不同培养时期的培养特征。 仪器 规格 数量 仪器 规格 数量 三角瓶 125毫升 1 烧杯 125-250毫升 1 250毫升 1 移液管 5-10毫升 7 漏斗 1 量筒 50毫升 1 比色管 25毫升 6 试管 20 2 实验二 纤维素酶的固体发酵 实验目的： 学习固体发酵技术 掌握发酵产物纤维素酶的提取及酶活测定 实验原理 纤维素是地球上数量最丰富的可再生生物质资源。全球每年光合作用的产物高达1500-2000亿吨，其中80%以上为木质纤维素类物质。自然界中，具有降解纤维素能力的微生物有近200种，其中丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群。纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 羧甲基纤维素钠（CMC） ，麸皮 2．主要仪器 （1）752型分光光度计、（2）恒温水浴槽、（3）沸水浴锅、（4）电炉子、（5）剪刀、（6）万分之一分析天平、（7）恒温干燥箱、（8）冰箱、（9）试管架、（10）胶头滴管 （11）具塞刻度试管 20mL×24 （12）移液管或加液器 0.5 mL×3；2mL×7 （13）容量瓶 100 mL×6；1000 mL×3 （14）量筒 50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1 （15）烧杯 100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1 3．试剂（均为分析纯） （1）浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液 将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg于100