大鼠肝细胞分离技术 原件.docVIP

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大鼠肝细胞分离技术 原件

0大 鼠肝细胞分离技术 材料:雄性大鼠 Collagenase IV,HBSS,DHanks,肝素,25%乌拉坦,100mM insulin/PBS,RPMI 1640,DMEM(10%FBS) 弯镊 2,直镊 2,眼科剪 1,止血钳 3,手术剪 2,弯剪 1,钩镊 2,Φ2mm 导管 2,5cm缝合线 3,200目稀网,5ml注射器 2,20ml 烧杯 1,大平皿 1,小平皿 2,托盘 1,无菌单 1。 DHanks、器械高压消毒; 配制0.02-0.03% collagenase IV/HBSS (DHanks+CaCl2)200ml,过滤除菌;培养基、insulin过滤除菌;75%酒精浸泡导管;DHanks、collagenase 37℃预热; 25%乌拉坦(或1-2%戊巴比妥 50mg/kg)腹腔注射; 备皮,碘酒消毒; 打开腹腔,充分暴露下腔静脉与门静脉,并各分离1cm,穿线;夹闭胸主动脉; 门静脉(或下腔静脉于肾静脉上缘)插管固定,用于接DHanks与collagenase; 37℃预热的DHanks门静脉灌流至肝脏变白,然后接collagenase,灌注5-8min; 取下肝脏置平皿内,加入10ml collagenase,弯钳轻柔撕开包膜,制成肝细胞悬液,37℃平摇消化20min,200目滤网过滤入离心管; 50g 5min×3次(或500rpm 5min×2次),得到细胞沉淀,台盼蓝染色观察活力;(用PBS稀释至0.4%

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