《关于拟南芥根系发育突变体M20的》李星煜.docVIP

关于拟南芥根系发育突变体M20的 植物分子遗传学初步分析 李星煜1 1北京汇文中学 指导教师:刘栋1 王晶1 许芸2 韩铄3 1清华大学植物分子遗传学刘栋实验室 2北京育才学校 3北京汇文中学 摘要 根承担着植物吸收水分和无机盐、固着和支撑、合成激素等重要功能。研究植物根系发育的调控机理，无论对于基础研究还是农业生产都具有重要意义。 本研究的研究对象拟南芥（Arabidopsis thaliana）是植物学中常见的模式植物，具有植株小、生长周期短、种子多、基因组小且被已完整测序等优点。 M20是具有显著短根表型、能稳定遗存的拟南芥根系发育突变体。本研究对其进行细胞学观察并采用分子遗传学手段对突变基因进行粗定位。 细胞学观察发现拟南芥根系发育突变体M20的分生区长度、成熟区细胞长度均小于野生型拟南芥；细胞分裂活性较野生型拟南芥无明显差别。图位克隆粗定位结果显示，其短根性状为单基因突变，突变基因位于1号染色体的顶端。 本研究所获得的结果将有可能为农作物根系结构改善提供理论依据和实践基础。 关键词：拟南芥 根系发育突变体 图位克隆 1 引言 1.1 根是植物的重要器官 根是维管植物体轴的地下部分，根分为根尖结构、初生结构和次生结构三部分。根尖分根冠、分生区、伸长区和成熟区。根生长最快的部位是伸长区。伸长区的细胞来自分生区。由根尖顶端分生组织经过细胞分裂、生长和分化形成了根的成熟结构拟南芥ColumbiMS培养基。 培养方法及生长条件 首先，将种子表面消毒： 计算所需种子的数量，用称量纸取到EP管中； 在超净工作台中，加入1ml 20%漂水，浸泡10-15min； 将消毒水吸出，用无菌水洗涤3-5次； 将无菌水吸出，加入适量0.1% agar悬浮种子； 然后，将种子在培养基中线性排列。4℃春化2天后竖直放入23 、长日照（16h光照，8h黑暗）000-6000Lux的植物生长室中。1:1，需要种在土中的植物先在1/2MS培养基平板上萌发一周左右，将幼苗转移到土中。 2.2 细胞学观察及分析方法 2.2.1 分生区长度的测量 将M20和Col的种子线性铺在1/2MS培养基上，竖直培养。分别于生长3天、6天、9天时取两种各10棵幼苗。剪取从根的尖端区域，移至滴入HCG的载玻片上。在微分相差干涉显微镜下对分生区细胞数量进行计数，并计算平均值和标准差。 2.2.2 成熟区细胞长度的测量 将M20和Col的种子线性铺在1/2MS培养基上，竖直培养。分别于生长4天和9天时取10棵M20幼苗和3棵Col幼苗。剪取从根的尖端区域移至载玻片上。在微分相差干涉显微镜下测量每条根上成熟区内10个细胞长度并取平均值及标准差。 分生区细胞分裂活性的观察 将M20与含有Cyclin-B的标记植株杂交，取F1代种子分别在P+和P-上培养。取F2代植株根的尖端区域移至载玻片上，在微分相差干涉显微镜下观察蓝色区域深浅程度及面积。 2.3 图位克隆 图位克隆技术是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。随着拟南芥基因组测序工作的完成，已经有很多的分子标记可以用于图位克隆。目前，适用最广泛的分子标记主要是简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphisms, SSLP）以及酶切扩增多态性（cleaved amplified length polymorphic sequences, CAPS）。它们都是基于PCR和琼脂糖凝胶电泳的分析技术，检测非常直接、方便。 本研究采用SSLP分子标记对筛选到的突变体进行粗定位。 2.3.1 DNA的提取 取拟南芥叶片研磨，每管加入600μlCTAB; 置于恒温65℃中30min~60min； 加入氯仿异戊醇（24：1）600μl，摇匀后静置5min； 放入离心机于转速12,000r/min离心5min，取上层清液； 加入400μl异丙醇； 取44管DNA，放入离心机于转速12000r/min离心10min，倒掉废液； 加70%乙醇500μl ~600μl，静置1min后倒掉乙醇； 静置30min； 加入无菌水后静置2min。 2.3.2 作图群体的制备 以突变体M20（Col生态型）为母本，Ler野生型为父本杂交，收F1代种子； F1代自交，收F2代种子； 在F2代幼苗中挑选带有突变表型的植株45棵，移入土中生长； 单株提取基因组DNA。 2.3.3 突变基因在染色体上的初步定位 粗定位SSLP分子标记 采用本实验室已有的分别分布于拟南芥5条染色体顶端、中间和末端的14对SSLP分子标记进行检测（见附录B） PCR扩增 反应体系： 基因组DNA模板 1.5μl 10μM Primer F 0.5μl 10μM Primer R 0.5μ