羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的研究.docVIP

羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的研究 　　作者：陈少强， 林建华 作者单位：福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系，福州 350004;附属第一医院骨科，福州 350005 　　【摘要】目的 探讨活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的可行性和最适条件。 方法 清洁型SD大鼠20只，用密度梯度离心结合贴壁法分离、纯化、培养大鼠MSCs，取长满25 cm×25 cm培养瓶瓶底的第3代大鼠MSCs，用2.5，5，10，20，40 Μmol/L的CFSE分别作用1，5，10，15，20 min后染色，通过观察染色后细胞荧光强度和细胞贴壁率筛选出CFSE标记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度。采用MTT法检测最佳条件CFSE标记的大鼠MSCs的增殖能力。 结果 浓度10 Μmol/L的CFSE在37 ℃下孵育10 min为MSCs染色、观察和研究的最佳条件。此条件下，CFSE标记的MSCs的增殖能力不受影响。 结论 活体染料CFSE是一种标记率高、细胞毒性小、操作简便的标记大鼠MSCs的新方法，浓度10 Μmol/L的CFSE在37 ℃下孵育10 min为CFSE标记大鼠MSCs的最佳条件。 　　【关键词】 荧光素; 乙酰乙酸盐类; 骨髓细胞; 间质干细胞; 染色与标记; 大鼠 　　骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓内的非造血干细胞，具有来源广泛、取材容易、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能、体内移植反应弱、克服了有关伦理学及免疫排斥问题等优点，是组织工程和细胞移植治疗的最佳种子细胞[12]。为研究MSCs的移植疗效，需对MSCs在体内的存活、迁移、分布及增殖、分化进行监测，因此需要有效的标记方法区别供体细胞和受体细胞。已有的标记物如放射性探针、荧光素探针和绿色荧光蛋白等用于MSCs标记，但在应用过程中也存在诸多问题。活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(5，6，2-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester，CFSE)是一种可穿过细胞膜、自动而且不可逆地与胞内蛋白和膜表面蛋白结合的荧光染料，近年来在神经科学和免疫学已有广泛应用[3]。但CFSE对不同细胞体外染色的标记时间和标记浓度不同[4]。为探讨CFSE标记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度，笔者应用CFSE对体外培养的大鼠MSCs染色进行系统研究，报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验动物 选用清洁级健康雄性SD大鼠20只，2～3月龄，体质量150～250 g[福建医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(闽2004-0008)]。 　　1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM培养基、胎牛血清FBS(美国HyClone公司);胰蛋白酶(Trypsin 1∶250，Amersco);PBS、FicollPaque分离液(美国Pharmacia公司);染料CFSE(美国Sigma公司);荧光标记小鼠抗大鼠单克隆抗体CD34PE、CD45FITC、CD29FITC、CD90FITC(美国PharMingen公司);Thermo Forma CO2孵育箱(3111，USA)，Beckman counter Epics XL流式细胞仪(美国BD公司)，倒置相差显微镜(IX70，德国OLYMPUS公司)，倒置相差荧光显微镜(CoiCB5203，德国OLYMPUS公司)，激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 MSCs的培养、传代与鉴定 大鼠氯胺酮(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，浓碘伏消毒。取双侧四肢骨，剪除干骺端，暴露骨髓腔，用10 mL培养液(含10 000 U肝素)冲洗骨髓腔。将所获骨髓缓慢加入已含FicollPaque分离液3 mL的试管内梯度离心(2 000 r/min，30 min)，吸取富含粒细胞中间界面层，PBS洗涤3次，制成单细胞悬液接种。培养条件为37 ℃、饱和湿度、体积分数为0.05的CO2，培养液为DMEM(含有10%FBS，100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素)。每3～4 d更换1次培养液，去除未贴壁细胞，至细胞融合时胰酶消化收集细胞，传代并检测CD34、CD45、CD29、CD90。 　　1.2.2 CFSE染色及最佳条件筛选 2.5 mg CFSE用500 ΜL二甲基亚枫(DMSO)溶解，制成10 mmol/L的储存液，放于-20 ℃冰箱内保存。临用前取适量，用MSCs培养基分别稀释成2.5，5，10，20，40 Μmol/L的不同浓度。取长满25 c