一种简化的重氮化法制备固定化酶的载体合成方法.pdfVIP

维普资讯 离子交换与吸附，2002，18(3)：205—210 10N EXCHANGEANDADSORPTION 文章编号：1001-5493(2002)03·0205-06 一 种简化的重氮化法制备固定化酶的载体合成方法 刘海燕 杨更亮 ’，” 孙素芳 。 李海鹰 ’ 陈 义 1河北大学化学与环境科学学院，保定 071002 2中国科学院化学研究所分子科学中心，北京 100080 摘要：重氮化法是固定化酶时常用的一种方法，用多孔玻璃等无机物作载体时，一般是先用 氨丙基三乙氟基硅烷与多孔玻璃等载体反应[1≈，生成烷基胺玻璃，然后与对硝基苯酰氯反应， 产物经过还原，生成带有芳胺的衍生物，最后进行重氮化．本文通过烷基胺与对氨基苯甲酸反 应，直接生成芳胺的衍生物．比常用的方法缩短了一步，通过在新合成的载体上对木瓜蛋白酶 进行固定化，研究了固定化条件对酶活力回收的影响，最适固定化夺件如下：pH为7．0．时间 为6h，酶量为240mg／g找棒，并比较了固定化酶和溶液酶的有关性质，考察了固定化酶的抹作 稳定性．结果表明，用这种方法合成的栽体固定化酶，其对热稳定性 操作稳定性及产率都比 较理想， 关键词：重氮化法 固定化酶 木瓜蛋白酶 中国分类号：Q814，2 文献标识码：A 1前 言 固定化酶在生物化学工程及酶工程学领域中占有十分重要的地位。在这个领域的主要 研究趋势包括固定化酶载体的制各和固定化方法的发展。在固定化方法中，重氮化法是一 种较重要的方法_l，这种方法所用的载体有多糖类、氨基酸聚合物、苯乙烯树脂和多 L玻 璃芳香胺衍生物等 但相比较而言，无机载体比有机载体更耐微生物降解、有更高的热稳 定性和更低的价格p】在用多 L玻璃等无机载体时，一般是先用Y．氮丙基三乙氧基硅烷与 多孔玻璃等载体反应_1．2】，生成烷基胺玻璃，然后与对硝基苯酰氯反应，产物经还原，转变 为带有芳胺的衍生物，再进行重氮化 本文 以硅胶为载体，与 ．氨丙基三乙氧基硅烷反应 后，再和对氨基苯甲酸反应，直接生成芳胺的衍生物，然厉用重氮化法固定了木瓜蛋白酶， 取得了令人满意的结果。 ·收璃 日期 ∞1年 l1月30日 哽目基盒：国家 自拣科学基金 ．州北省 自然科学基金 (200077)；(202096) 作者简介 ：刘海燕．盘(197卜)．河北省人．顼士 ．．通讯鞋系人 维普资讯 ·206· IonExchangeaadAdsorption 2002年 6月 2实验部分 2．1 仪器与药品 UV．3000紫外分光光度计 (Shimadzu)；木瓜蛋白酶 (北京双旋微生物培养基制品厂． 生化试剂)；酪蛋白 (北京双旋微生物培养基制品厂．生化试剂)；硅胶 (青岛海洋化工有 限公司．500mesh)；7-氨丙基三乙氧基硅烷 (武汉大学化工厂)。 2．2 试剂的配制 酪蛋白溶液：取酪蛋白1．000g．加0．1moLL 磷酸缓冲液 (pH7．0)50m1．沸水浴中煮 沸30min，不断搅拌，冷却至室温，用磷酸缓冲液稀释至 100ml。 原酶液：称取 1．200g木瓜酶-用适量硼酸钠溶液 (0．ImoLL，pH8．7)溶解，然后定 容至 50ml。 酶活性剂：称取盐酸半胱氪酸 O．395g和乙二胺四乙酸二钠 0．374g．先用少量磷酸缓 冲液 (O．01moLL ．pH7．0)溶解，然后定容至50ml。 三氯醋酸溶液 (TCA)：取三氯醋酸 18g，加醋酸钠 30g和冰醋酸 19m1．用适量水溶 解后．定容至 1000ml。 2_3 实验方法 2．3．1 栽体的合成 2．3．1，1 硅胶的活化 参照文献4【I．称取 15g硅胶于250ml三颈瓶中．加入6moLL 盐酸 130m1．在搅拌状态 下加热回流 24h，冷却后过滤，用二次蒸馏水洗至中性．再用丙酮洗涤数次．然后 160C 真空干燥 12h，最后放入干燥器中备用。 2,3．1．2 氨丙基硅胶的制各 按文献 方法制备。 2．3．1．3 芳香胺的