乙醇脱氢酶Ⅰ类基因全长cDNA的克隆与表达.pdfVIP

乙醇脱氢酶І类基因全长 cDNA 的克隆与表达 1 2 * 周文婷 ，崔羽，王晓燕 ，张永红，李世荣，李景鹏 1 （东北农业大学生命科学与生物技术中心，哈尔滨 150030 ； 哈尔滨医科大学附属第四医院检验科，哈尔滨 1500012 ） 摘 要：І类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用，由ADH1 、ADH2和ADH3 组成。根据序列数据设计一对引物，利用RT-PCR 同时克隆乙醇脱氢酶І类基因全长cDNA 。 测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB 11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过 检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性测定。经检测重组ADH1 ，ADH2和ADH3 的酶活 力分别为1.8± 0.3U/mg, 0.9±0.2U/mg和1.4±0.2U/mg。 关键词：乙醇脱氢酶（ADH ）；基因克隆，原核表达；酶活力检测1 酒是重要的消费品。现已知乙醇及其代谢产物是包括癌症在内的许多疾病的重要诱因。 乙醇脱氢酶 （Alcohol dehydrogenase，ADH ）是催化乙醇代谢初始反应的重要酶[1]。根据酶 学及DNA/蛋白质序列上的差异，人类ADH被分为五类[2]，其中Ⅰ类ADH 由ADH1 、ADH2 和ADH3组成，在乙醇代谢中发挥主要作用[3]。现已发现ADH2和ADH3位点均存在基因多态 性，从而使所编码酶在乙醇代谢过程中表现不同的催化速率。一般认为编码高活性乙醇脱氢 酶的等位基因ADH2*2和ADH3*1能够降低东亚人乙醇相关疾病的患病风险。 乙醇脱氢酶Ⅰ类基因的克隆已有很长时间[4]，然而国内尚无此类报道。由于该类基因 的获得是深入进行其分子组成分析及结构研究的基础，本文中，我们以一对引物同时克隆该 类基因，并在大肠杆菌中获得稳定表达。经检测，获得的重组酶具有较高的生物活性。 1. 材料与方法 1.1 材料与试剂 五月龄流产胎儿新鲜肝、肾组织，切小块液氮中急速冷冻，-80℃保存。E.coli ER2566、 表达载体pTYB 11 及IMPACT™-CN蛋白纯化系统购自NEB 公司。限制性内切酶购自Takara 。 pGEM-T载体系统及M-MuLV 逆转录酶购自Promega 。TRIzol试剂及NAD+氧化性辅酶Ⅰ购自 Gibco 。酵母醇脱氢酶标准酶制剂购自Sigma 。 1.2 Ⅰ类乙醇脱氢酶基因cDNA 的克隆及pGEM-T-ADH 重组质粒的鉴定 按Trizol试剂说明书提取肝、肾总RNA 。因该类基因具有约95% 同源性，根据GenBank发布 的该类基因多个mRNA序列同源区设计引物P Ⅰ 5 ’GAATTCATGAGCACA GCAG 3’ 和P Ⅱ 5’CTCGAGATGTAGGGTAGAGGAGGC 3’，各自带有EcoR Ⅰ和Xh o Ⅰ酶切位点。按说明书 *电子信箱：E-mail:ljingpeng@ -1- 进行RT-PCR扩增，获得的cDNA与pGEM-T载体分别连接，重组质粒经EcoR Ⅰ /Xh o Ⅰ双酶 切初步鉴定。比较三个基因的限制性内切酶图谱发现，1-375范围内，ADH1 在第171碱基处 有一个Kpn Ⅰ酶切位点，ADH3 在第133碱基处有一个Pst Ⅰ酶切位点，而ADH2 在这两个位置 无酶切位点。据此，设计引物PⅢ 5 ’CAATATGAGCACAGCAGGAAA 3 ’和PⅣ 5’CCACACTGAGGAGTAAAGAGC 3’进行PCR扩增并对扩增产物分别进行Pst Ⅰ和Kpn Ⅰ单 酶切，对鉴定的重组子测序并对测序结果进行分析、比较。 1.3 ADH1-3基因cDNA的表达与纯化 重组载体pGEM-T-ADH与表达载体pTYB 11分别经EcoR Ⅰ/Xh o Ⅰ双酶切，获得的cDNA 与表达载体连接后转化大肠杆菌ER2