黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件初探.pdfVIP

长江大学学报(自然科学版) 2009年9月第6卷第3期：农学 JournalofYangtzeUniversity(NatSciEdit) Sep．2009．Vo1．6No．3：AgriSci doi：10．3969／j．issn．1673—1409(S)．2009．03．016 黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件初探 刘 辉 ，冯常辉 (长江大学生命科学学院，湖北荆州434025) [摘要]采用黑 曲霉 (Aspergillusniger)液体发酵生产纤维素酶，研究了碳源 、氮源、培养基起始pH对该菌株 产纤维素酶活力的影响。结果表 明，在温度 3O℃、pH5．5下培养 120h的条件 下确立 了产酶最佳培养基是 6 的稻草粉 、1 的黄豆粉 ，其 纤维素酶 的最高产量是89．2U／mL。 [关键词]黑 曲霉(Aspergillusniger)；纤维素酶 ；液态发酵 [中图分类号]TQ92O．1 [文献标识码]A [文章编号31673—1409(2009)03一S050—03 随着全世界能源危机、粮食危机、环境污染等问题 的日趋严重 ，纤维素酶的研究和开发利用再次成为 人们关注的热点。纤维素酶的应用已从传统的医药 、食品深加工、饲料 j、饮料、酒 、酱油和食醋酿造等行 业 ，扩展到单细胞发酵、纺织工业 、造纸工业、环境污染治理等新领域_l2]。然而 ，目前纤维素酶生产的菌株 ， 绝大多数集中于木霉，而木霉的发酵产物中存在多种毒素，纤维素酶系仍欠齐全_3]，致使纤维素酶的应用 受到限制。人们应用激光诱变技术l4]，筛选到一系列有生产潜力的黑曲霉菌株 ，综合测定表明其 中有些菌 株 比较理想，能产生纤维素酶。本研究对黑曲霉发酵的产酶条件和最适作用条件进行 了初步探索 。 1 材料与方法 1．1 材料 ． (1)菌种 黑曲霉 3275，由长江大学生命科学学院微生物实验室优化选种 。 (2)培养基 斜 面培养基 ：PDA 培养 基；种 子培养 基：葡 萄糖 3 、麸皮 l 、(NH )SO 0．15 、 pH5．5～6．0；发酵培养基 ：稻草粉 6 、黄豆粉 1％、KH2PO 0．45Ao、CaC10．25 、pH5．5～6．0。 1．2 方法 (1)纤维素酶液体深层发酵 将新鲜 的斜面菌种的孢子接人种子培养基 。3O℃、摇床上培养 48h 后 ，按 10 的接种量接入产酶培养基 中进行发酵试验 ，摇床 l50r／min，30℃下培养 120h停止发酵。 (2)酶活力的测定 羧 甲基纤维素酶 (CMCase)的活力测定 ：DNS法 ]。取 0．5mL稀释了25倍 的 酶液 ，加入 0．5 的CMC溶液 2．5mL，在 50℃下酶解反应 0．5h，加入 6mLDNS试剂。然后沸水浴 10 min，显色测出还原糖量 。对照葡萄糖标准 曲线计算出酶活力 ，酶活力单位定义为 1h水解生成 1mg葡萄 糖 的酶量为 1个活力单位。 (3)pH对菌株生长影响的测定 在温度 30℃下 ，以pH 3．0、3．5、4．0、4．5、5．0、5．5、6．0和 6．5条件 下测定酶活力D：。值 。 (4)最佳培养基材料的测定 在温度 3O℃和最佳 pH条件下，碳源的浓度定为 695／，以稻草粉 、米糠 、 麸皮 、甘蔗渣为原料进行优化选择；氮源浓度定为 1 ，以(NH )SO 、尿素、NHC1、蛋 白胨、黄豆粉 、酵母 膏和 NH NO。进行优化选择 。 (5)培养基正交实验 根据预备实验，设计 2因子 4水平的正交试验 (表 1)，在温度 30℃下进行培养 基 的正交实验 。 [收稿日期]2008—11—04 [第一作者简介]刘 辉(1977一)，男，湖北武汉人，理学硕士，讲师，现从事分子生物学研究 第 6卷 第 3期 ：农学 刘 辉等 ：黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件初探 2 结果与分析 2．1 葡萄糖标准 曲线的绘制 葡萄糖溶液浓度 一1．4628z+O．0469。式中，Y代表相 当葡萄糖量 ，mg／mL； 代表酶解反应产物 溶液经显色后所测的光密度值 。酶活力计算公式为 CMCase一(y／25)×9×25