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基因克隆的基本原理及实验技术 课时及内容安 排 第一课时: 基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项 第三课时: 实验操作过程演示(录像) 第一课基因克隆的基本概念及理论知识 基因克隆的定义： 什么是基因？ 1、基因是存在于细胞内有自体繁殖能力的遗传单位。 2、基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。 3、编码一个RNA或一条多肽链的DNA片段称为一个基因。 4、基因是生物体遗传的基本单位，存在于细胞的染色体上，作直线排列。 5、基因通过指导蛋白质的合成来传递遗传信息，从而控制生物的性状。 染色体、DNA 与基因之间的关系 基因的结构及其表达蛋白的过程 RT-PCR扩增基因的编码区序列 转录起始调控区（启动子区）的扩增 基因的编码区及启动子区序列必须通过连接到质粒上构建成重组表达载体，然后进行目的片段扩增及功能研究。 什么是质粒（Plasmid）？ 质粒的重要特征 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的命名法则 DNA连接酶 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键将两条紧邻DNA链连接起来。 内切酶和连接酶是基因克隆实验中两种重要的工具酶，它们如同分子生物学家剪刀和针线，可以任意地将感兴趣的基因片段进行切割和连接，实现DNA序列的重组。 质粒(plasmid)和载体(vector)有什么区别？ 载体的种类 非定向克隆 TA克隆载体 酶切位点定向克隆的克隆载体 非定向克隆 表达载体 原核表达载体 真核表达载体 目的蛋白表达载体中的表达盒 大肠杆菌 生物安全性 基因克隆的实验常用菌株 1：DH5a 常用于质粒克隆的菌株。使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 2：TOP10 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 3：HB101 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。 4：JM109 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。 5：BL21(DE3) 用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 质粒转化大肠杆菌的过程 基因克隆实验的一般过程 基因克隆实验室安全事项 仪器设备的使用及维护 1. 移液器(加样枪) 分子克隆常用的有毒试剂 1. 溴化乙锭: （Ethidium bromide，EB）用来染DNA和RNA的染料, 是一种致癌物质；它是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。 有累积效应，不要直接接触，但是要注意通过呼吸摄入，故此环境要通风。EB可以被皮肤吸收。做实验的时候一定要带手套。但是，只要按照标准的操作使不会有问题的。严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。 2. DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂；DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。 基因克隆相关实验 大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。 大肠杆菌在生物技术中的应用 大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系。 生物工程用的菌株是在不断筛选后被挑选出的菌株。这些菌株由于失去的细胞壁的重要组分，所以在自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这