脂联素基因突变-11377C%2fG检测方法建立及与2型糖尿病关系及研究.pdfVIP

第五届华北地区三省两市检验医学学术会议论文汇编 脂联素基因突变一l1377C／G检测方法建立及 与2型糖尿病关系的研究 裴林1 贾玫1乔博明1张旗2 1北京大学人民医院检验科(100044)2中心实验室 2diabetes (insulinresistance，IR)、2型糖尿病(type nucleotide 脂联素基因常见的单核苷酸多态性(single 变与2型糖尿病和(或)胰岛素抵抗存在相关关系，这种相关性主要由于突变影响了脂联素的表 达水平及其功能。 近年来国外研究发现aPMl启动子区域存在．11377C／G多态性，并证实该多态性与肥胖、胰岛 讨血清脂联素水平及aPMl．11377C／G多态性与T2DM的相关性。 对象与方法 一、对象 来源于2009．1至2009．12我院内分泌科住院患者及我院健康体检医务工作者。分为糖尿病组 准。②Nc组：89例(男21／女68)，空腹血糖(FBG)6．1mmol／L，无糖尿病史。 二、方法 1．测定身高、体重、计算体重指数(BMI)，测定腰围、臀围，计算腰臀比(WHR)。 2．血液生化指标的测定血清脂联素水平检测方法为双抗体夹心ELISA法，使用美国DYELEX MR酶标仪，试剂盒由美国RD 公司Opsys 素(PINS)测定使用罗氏2010型电化学发光仪；试剂、定标品及质控品均由罗氏公司提供。总胆 胆固醇(LDL)测定使用日立7170全自动生化分析仪；试剂、定标品及质控品均由日本和光公司 提供。HbAlC测定使用高压液相亲和层析法，试剂、定标品及质控品均由美国Pfimus公司提供。 提取试剂盒，采用EDTA．K2抗凝新鲜全血标本，按试剂盒要求进行操作，提取基因组DNA标本．80C 保存备用。 4．人aPMl．11377C／G点突变不同基因型质粒标准品的获取等位基因野生型质粒标准品：上游 引物序列 5’AGAACCGGcTCAGATCCTGTC3’；下游引物序列 杆菌进行克隆，提取质粒经测序确定后作为等位基因野生型质粒标准品。等位基因突变型质粒标 ·278· 第五届华北地区三省两市检验医学学术会议论文汇编 测序确定后作为等位基因突变型质粒标准品。等位基因杂合型质粒标准品：将等量野生型和纯合 突变型质粒标准品混合作为等位基因杂合型质粒标准品。对不同基因型质粒标准品配制成 5×1 07copies／ml，．80℃保存备用。 5．引物及TaqMan探针设计引物设计采用PrimerPremier5．0软件，由上海生工生物技术有 限公司合成，北京赛百盛生物技术公司合成TaqMan探针。．11377C／G点突变扩增片段长度 上游引物扩增的模板链互补。TaqMan探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭基团 TAMRA(表1)。 表1 ARMS—TaqMan方法检测aPMl基因C．11377G点突变引物及探针序列表 C．11377GWsense AGAACCGGCTCAGATCCTGTC C．11377GMsense AGAACCGGCTCAGArCCTGTG C．11377Ganti．sense AGCAGCCTGGAGAACTGGAAG TaqManprob CAAAACATGAGCGTGCCAAGAAAGTC 注：W：野生引物；M：突变引物 10ul，上、 下游引物各0．4uM，TaqManprob0．8uM，模板2．5ul，使用BIO．RAD2荧光定量PCR仪检 Opticon 测TaqMan探针FAM荧光信号。反应条件940lOmin，94C30see，60(3 60sec40个循环。 三、统计学分析 采用SPSSl3