荧光定量聚合酶链反应测定乙型肝炎病毒DNA+不确定度评定应用.pdfVIP

荧光定量聚合酶链反应测定乙型肝炎病毒DNA 不确定度评定与应用 沈伟锋 丁韧烨 杨清萍 邵平扬 嘉兴市第一医院检验科分子生物学实验室 荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）是目前国内乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）检测应用最广泛的 方法，虽然FQ-PCR 测定具有较高的灵敏性，但不同实验室或同一实验室不同时期的检测结果可比性 难以保证，使其临床应用还存在一定的局限性。实验室如何可信的比较来自不同实验室的结果或同 一实验室不同时期的结果，是目前尚待解决的问题。量值溯源性的建立可以达到使不同实验室或不 同时期检测结果的一致性，但目前国内外定量PCR 测定HBV-DNA 量值溯源体系尚未建立与完善。测 量不确定度是测量结果所含有的一个参数，用以表示被测量值的分散性，是建立量值溯源性的基础， 因此我们参考有关文献，对FQ-PCR 测定HBV-DNA 测量不确定度进行评定，现报告如下。 材料与方法 一、材料 4 5 1．标本：取 2 例临床确诊乙型肝炎且乙型肝炎病毒 DNA（HBV-DNA）拷贝数分别在 10～10 拷 7 8 贝/ml、10 ～10 拷贝/ml 的患者血清，用于批内重复性实验。临床被检测标本均要求无溶血、无脂 血现象，采血后6 小时内检测。 2．试剂：HBV-DNA 荧光定量PCR 试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司产品，检测线性范围： 3 9 （1×10～1×10）拷贝/ml，严格按照试剂盒说明书操作。HBV-DNA 分子生物学室内质控物（批号 2005006）由浙江省临床检验中心统一提供，为中山大学达安基因股份有限公司产品，其稳定性与均 一性均达到国家一级标准物质的要求（一级标准物质技术规范，JJG1006～1994）。 3．仪器：Lightcycler 实时荧光定量PCR 仪为Roche 公司产品。 二、方法 1．测量不确定度的评定程序：通过对FQ-PCR 检测HBV-DNA 测量过程的分析，确定并简化测量 不确定度的来源；利用实验室提供的方法学性能数据（不确定度A 类评定）以及通过参加卫生部临 床检验中心组织的HBV-DNA 室间质量比对活动所提供的数据（不确定度B 类评定）两种方法来量化 各不确定度分量，本研究中所有不确定度分量全部采用标准不确定度（即标准差）表示；分别评定 测量观测值n=1、2、3 三种情况下的合成不确定度和扩展不确定度。 2．不确定度A 类评定：实验室可提供的方法性能主要包括批内重复性和批间重复性。①批内重 4 5 7 8 复性分析：以不同浓度水平的两例乙型肝炎患者血清（10 ～10 拷贝/ml、10 ～10 拷贝/ml）为标 本，同批平行测定各30 次。分别求得两个浓度水平上的批内标准差[S（w）]；由批内重复性引起的不 确定度u（w）=S ( w ) （n 为测量观测值个数）。②批间重复性分析：根据 HBV-DNA 分子生物学室内质 n 4 5 7 8 控物低值浓度（10 ～10 拷贝/ml）和高值浓度（10 ～10 拷贝/ml）两个浓度水平 30 批次室内质 S (b) 控数据，分别求得两个浓度水平上的批间标准差[S n （b）]；由批间重复性引起的不确定度