阿魏酸钠对小鼠H22肝癌生长的抑制作用和其机制研究.pdfVIP

夯盎≈≈够#吠允≈≈掰状#勘 》活性成分碍究》 泞一、o一。：q、二．一。^·一·、￡一二甚 阿魏酸钠对小鼠H22肝癌生长的抑制作用及其机制研究 徐晓玉，陈伟海 (重庆医科大学中医药学院，重庆40005I) 阿魏酸钠化学名称为3-甲氧基一4-羟基桂皮酸钠盐二水化合物，为非肽类内皮素受体拮抗剂。阿魏酸 钠现在主要用于动脉粥样硬化、冠心病、脑血管病、肾小球疾病、肺动脉高压、糖尿病性血管病变等心 脑血管疾病。也有文献报道阿魏酸钠在体外对肿瘤细胞有抑制作用，但尚未有抑制肿瘤生长的整体动物实 ferulate，sF)对肿瘤生长及肿瘤血管生成的抑制 验的报道。本实验运用H22荷瘤小鼠研究阿魏酸钠(sodium 作用。并对可能机制进行了研究。 1材料与方法 1．1细胞株：H22小鼠肝癌细胞株，重庆医科大学检验系提供。ECV304血管内皮细胞株．中国科学院上 海细胞生物研究所提供。 1．2主要药品、试剂及仪器：阿魏酸钠，购自成都第一制药有限公司(批号031103)。新生牛血清，购自 杭州四季清公司。兔抗人CD34抗体。兔抗人PCNA抗体、兔抗人VEGF抗体，均购自SantaCruz公司。 Isolation DAB显色试剂盒、sP染色试剂盒，购自美国ZYMED公司。Trizol Reagent、AMV逆转录试齐J CATTGCTCTGTGCCT 引物，购自上海生物工程有限公司。VEGFl65上游引物序列：5’CCC 3’：下游 ACAAACCCATTCCTG 引引物序列：5’ACG GTCCATGCCATCAC3 ACCACCCTGTTGCTGTA 7．下游引物序列：5TCC 3’，扩增长度为560bp。 全自动酶标仪(MK3)，芬兰雷勃公司产品：PCR扩增仪(22331 图像分析系统(ZF-4)，PharmaciaBiotech公司产品。 1．3实验动物：清洁级昆明小鼠，189也29，雄性，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK (渝SPF条件饲养，实验动物使用许可证号：SYXK(渝 1．4肿瘤模型的制各及处理：昆明小鼠每只右前肢腋下皮下注射密度为2×1061ml的H22细胞0．2ml。随 机分为4组，每组14只，从接种后第2d起，每天定时给药，阴性对照组每天注射生理盐水0．5ml；阿魏 腹腔注射阿魏酸钠。连续给药14d。从给药后第3d起开始测量肿瘤体积．每三天测量一次。肿瘤体积的 计算方法参照文献，按下列公式计算：肿瘤体积(V)=0．5236×长×宽。 1．5一般组织学处理：停药后第2d，处死小鼠，解剖并完整剥离出小鼠肿瘤，称重，按以下公式计算抑 瘤率：抑瘤率(％)=对照组平均瘤重一试验组平均瘤重，对照组平均瘤重×100％。 按免疫组化常规方法操作，sP染色。微血管计数方法，参照文献，采用“热点”法．即在100倍低倍镜下， 选取五个微血管密度最高的区域，400倍视野下，每一个着色的单个内皮细胞或细胞串计为一个微血管。 ——39—— 倍镜，计算阳性细胞的平均数。 中选择590rim波长测各孔光吸收值(OD值)。 1．8VEGFmRNA转录：收集小鼠肿瘤组织．每100 Trizol，彻底匀浆；加入0．2ml氯仿， mg组织加lml 剧烈振荡混匀30S，然后40C．12000rain；加入等体积异丙醇，室温下放置5min，再40c， rpm，离心5 表达水平的参数，对VEGFPCR产物作相对定量分析。 2结果 2．1阿魏酸钠对肿瘤生长的影响：所有小鼠接种后第15d处死。成瘤率100％。阿魏酸钠各剂量组肿瘤生 长