流式细胞仪在检验医学中的应用.docVIP

流式细胞在中的应用 1。监测细胞免疫状态 ? 细胞免疫功能不但与恶性肿瘤、免疫系统的疾病有关；而且还与为数众多的受神经内分泌--免疫功能轴影响的状态或疾病有密不可分的联系。因此监测免疫状态如同检查神经和内分泌功能一样重要。流式细胞术提供了简捷地检测淋巴细胞亚群的方法，1993年在波士顿召开的人类白细胞分化抗原会议(leukocyte differentiation antigen，HLDA),将CD抗原(cluster of differentiation)分为T细胞、B细胞、髓细胞、血小板、内皮细胞、自然杀伤细胞、活化抗原、粘附因子、细胞因子和细胞因子受体等九个组，确立了48种新抗原。到2000年7月，第七届人类白细胞分化抗原会议的召开，CD抗原已达200种。CD系列在免疫学中常被用于:(l)CD抗原的基因克隆，新CD抗原及新配体的发现;(2)CD抗原功能与结构的关系;(3)细胞激活途径和膜信号的传递;(4)细胞分化过程中的调控;(5)细胞亚群的功能。CD3、CD4、CD8的表达反应细胞免疫功能，CD4/CD8升高则与自身免疫疾病有关，如类风湿、SLE等，降低主要见于病毒感染和恶性肿瘤。美国疾病控制中心 (CDC)于1991年提出将淋巴细胞CD4的绝对值小于200个/μL的人类免疫缺陷病毒 (HlV)感染者列入艾滋病的诊断标准中，即把没有临床症状或临床症状不够原定标准的HIV感染者列入艾滋病病例。CD4细胞的绝对值被用作临床分型的重要依据。吞噬细胞在一定条件下吞噬微球或荧光素标记的金黄色葡萄球菌、酵母菌，应用FCM测定其荧光值即可作吞噬功能试验。用荧光素标记的羊抗人IgG Fab和包被C1q补体的聚苯乙烯微球与血清中的免疫循环复合物作用，根据荧光量的多少可定量测定循环免疫复合物。  2。造血干细胞移植的监测 骨髓移植、脐血移植的实质是造血干细胞移植。造血干细胞移植是白血病和实体肿瘤放疗、化疗后最有效的治疗治疗措施。通过FCM监测供体标本中CD34阳性细胞的多少即可得知造血干细胞多少，因CD34是造血干细胞的特异标志。也就是说，供体标本干细胞的多少直接决定治疗效果的好坏。若采用外周血干细胞移植，在给供体注入造血因子刺激骨髓后定时检测外周血中CD34阳性细胞数量，抽取CD34阳性细胞数最高时的标本为最佳。这是花钱最少、效果好、疼痛最少、最为安全的造血干细胞移植法。 3。组织配型与监控移植物的排斥反应 ? ? 人体脏器移植日益增多，流式细胞术不但提供了组织相容性抗原配型快速反应的测定方法，而且可以随时监测免疫排斥反应，常被用作免疫抑制治疗过程中免疫抑制剂如环孢素的用量与疗程的监控指标。FCM为现代移植医学打开了崭新的一页。成功的心脏移植便是利用FCM监视排异状态，及时准确地提供了完整的免疫指标。临床移植免疫学在哪些方面可得益于FCM呢?首先可用来鉴别和定型同种异体反应抗体，通常能极为精确地检出高危的供者和受者(不适合地)匹配;其次通过检测免疫系统的细胞成分及亚型的改变，有助于排异、感染和药物中毒的鉴别诊断;还能够用FCM进行T细胞受体分析以便确定免疫抑制治疗是否适合，有利于移植物受者的生存。多年来，人们建立了许多新的FCM方法应用于临床移植，以下就此作一概述。 ? ? (l)检出HLA I类和II类特异性抗体：Harmer等人(1993，1998)建立了两个细胞库，每个库含有l0个用EB病毒转化的B细胞系，这20个细胞系基本能代表所有广泛分布的HLA-A和DR抗原及大多数亚类，只有极少数HLA-B和C抗原未包括在内。40ul细胞悬液(5x106/ml)与lOul待检血清在22℃保温3Omin，用含小牛血清及叠氮钠的磷酸缓冲液洗两次并复悬到30ul，加入4ul FITC标记的抗人IgG抗体，置4℃ 3Omin，洗两遍后复悬到5OOul,即用流式细胞仪测定，用阴性对照设门(在阳性门内低于2%);高于本底2%的值为阳性结果。本方法经与传统的补体依赖淋巴细胞毒试验(CDC)及商品化ELISA试剂PRASTAT的结果比较，证明流式细胞术筛查是检测HLA特异性抗体的最灵敏的方法，并且与PRASTAT有明显的正相关。 ? ? (2)流式细胞术交叉配型(FCXM)。Garovoy等人(1983)建立本法后，经不断完善，已被广泛采用。日前常用步骤是分离供体淋巴细胞(3xlO5)，加入5Oul受者血清，37℃保温3Omin，用含叠氮钠的PBS洗两遍，加入25ul FITC标记的抗人免疫球蛋白的羊IgG F(ab)2，置4℃ 3Omin(避光),洗两遍后用PBS-AZ复悬至2OOul，用流式细胞仪测定。以未加受者血清的(仅有T细胞与FITC标记物)为阴性对照，荧光道数大于对照2S者为阳性结果。诸多文献证实FCM比标准的CDC检测更为敏感,