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本研究拟运用SRAP标记对中国.doc

本研究拟运用SRAP标记对狗牙根品种。材料 24个狗牙根品种属于两个种杂交狗牙根3普通狗牙根21(表)。生长在江苏省中科院植物研究所,小区为5050cm2。对种源进行正常浇水施肥所有都在其正常成长且和健康的植株上取样。 24份狗牙根DNA指纹图谱是根据Visual Basic 6.0软件并结合人工目测进行构建。然后,将DNA指纹被转换成二进制码,用1和0代表相应扩增片段的出现和缺失。例如,扩增出的13条条带二进制码可能为0000101100100。一个扩增片段被命名是根据该引物组合扩增出片段大小(bp)来决定的。例如e5-Em7-250指e5-Em7引物组合扩增250 bp片段。 每个狗牙根品种的DNA是运用SDS方法从新鲜叶片中提取,并λDNA as reference to 检测sample DNA浓度,最后调整至50ng/ μ(Guo et al., 2007)。运用90对引物分析24个品种(表2)排除难以计数的或不能扩增出整齐的引物,这90对引物中共有30个组合(表3)。 扩增Li 和Quiros(2001)的程序略作修改,反应体系总量为20 μL, 2 μL 10×buffer、40 ng模板DNA、 Mg2+1.25 mmol·L-1、dNTP 260 μmol·L-1、Primer 0.2 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U,PCR扩增程序为: 94 ℃预变性4 min;94 ℃变性1 min,37℃退火1 min,72 ℃延伸10 s,5个循环;94 ℃变性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸10 s,35个循环;循环结束后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存, 扩增反应在英国TECHNE公司的TC-412 PCR仪上进行。扩增产物取10 μL,用.0%非变性聚丙烯酰胺(19 acrylamide : 1 bisacrylamide )×TBE buffer (90 mM Tris-boracic acid, 2 mM EDTA; pH 8.0)上凝胶分离,快速银染检测(电泳仪为DYY-8B型电泳仪,电泳槽为 JY-SCZ6 双垂直电泳槽)(Guo et al., 2007)。 每个片段出现缺失的编码为10,如1表示存在一个特定的等位基因,0表示没有。利用NTSYS-pc 软件(版本2.1)距离矩阵和树状建遗传多态性(p-5%)基因多样性和香农信息指数是用来计算Nei’标准遗传距离系数,并建构UPGMA树状图。PCA (Principal Coordinate Analysis)分析利用部分的NTSYS-pc 软件包进行分析(Nei and Li, 979)。

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