硫堇组化染色技术在显示细胞核DNA应用.pdfVIP

●———■■’·—_·姊卿_—·、 f中荤瞽争合l；藩麓簇喜登霎羹翥蝴 l藁妻2010 为宜；脂肪组织切片较难，一般冷室温度调节到一30℃以下为宜，切片厚度可为10-15 微米。在科研及动物实验的研究方面，动物眼球试验相对较难(眼球晶体较硬)。在制 作眼球切片时，为了完整的眼球切片，我们在使用OCT包埋过程中，应尽可能的把眼球 完整的包裹于OCT包埋剂中，切片厚度一般不超过14微米，必要时可用手指进行雾化， 以达到切片完整无皱褶、无裂痕。 2．染色：切片立即放入丙酮固定液中固定30秒一冲水一苏木素染色为2--3分钟 (苏木素染液要定期更换)一冲水一盐酸酒精分化3秒～冲水一氨水返蓝3秒一冲水一 进行伊红颜色时间为20～30秒(伊红染液要定期更换)一冲水一进行梯度酒精(75％～ 100％)脱水一进入二甲苯透明(最好使用三缸二甲苯，使透明充分)一封固。制作好的 切片要求完整薄厚均匀、无皱褶、无裂痕现象，染色要胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红蓝 适度，封固美观。 硫堇组化染色技术在显示细胞核DNA中的应用 细胞DNA含量反映细胞生长及分化状态，测定其含量的变化对判断肿瘤的性质及预 后具有重要意义。在进行各种肿瘤细胞核DNA含量图像分析时，发现细胞核DNA染色质 量的好坏直接影响DNA含量测定结果的准确性。应用中发现传统的Feulgen染色技术存 在染色特异性不强，背景易共染，染液配制较复杂，对反应条件要求严格，染色时间较 长，切片易褪色等缺点。为此，我们根据细胞核的结构特点，采用硫堇对细胞核DNA进 ‘行染色，获得了良好的染色效果。 1材料和方法 1．1标本选取常规活检扁桃体、淋巴结组织标本。用福尔马林lOml，甲醇85ml， 冰醋酸5ml混合固定液固定组织，切片厚5|lm。 147 学术论文黧 I．2硫堇染色液的配制先将0．29硫堇溶于200M蒸馏水中，加热使其溶解，再加 溶解后，过滤，瓶口封好，置冰箱内备用。 1．3染色步骤①切片脱蜡至蒸馏水；②7mol／L盐酸室温下作用30min，蒸馏水洗； ③入硫堇染色液，室温下染色60min，蒸馏水洗；④1％偏重亚硫酸钠漂洗3次；自来水 洗；⑤常规无水酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。 2结 果 细胞核DNA呈蓝色，细胞质、背景无色(图l，2)。 3讨论 细胞DNA含量反映细胞生长及分化状态，其含量的测定对判断肿瘤性质、预后具有 重要意义[1，2]。在细胞核DNA含量测定过程中，现多采用传统的Feulgen染色法[3] 对DNA进行染色，但在应用过程中发现此法特异性不强，背景易共染，染液配制较复杂， 染色时间较长，反应条件较难控制，染色结果极易受组织固定液种类、盐酸水解时间和 温度的影响，使得染色结果不稳定，致使DNA含量测定结果不准确。另外，我们发现， 染色后的组织切片放置一段时间后容易褪色，不利于肿瘤细胞核DNA含量测定的回顾性 研究。为此，我们根据细胞核的结构特点，采用硫堇对细胞核DNA进行染色，收到较好 的染色效果。硫堇属于噻嗪类染料，其染色原理：利用酸解的方法打断DNA分子链中的 嘌呤一脱氧核糖键，即去嘌呤作用，然后DNA部分区域发生重排，暴露出醛基，硫堇能 与细胞中的醛基反应形成一种醌型化合物，使细胞核DNA染成蓝色。经实际应用证实， 硫堇染色法较传统的Feulgen染色法染色结果清晰可靠，特异性强，背景干净，染液配 制方便，染液较稳定，染色方法简单，染色时间短，切片无褪色现象发生，从而为肿瘤 细胞核DNA含量图像测定提供了一种可靠的组织化学染色技术。 DNA染色质量的好坏与前期组织固定有密切关系，固定的目的一是：未经固定的细 胞核在染色水解过程中，会使DNA形成小片段，游离出细胞核，影响DNA测量的准确性； 二是：固定可以封闭那些在水解前产生的醛基，减少假阳性产物。固定液可以使DNA分 子空间结构发生改变，影响对酸水解的敏感性。如果固定液选择不当或组织固定时间过 长，染色反应的强弱就会存在很大差别，一般染色质着色较淡。我们认为福尔马林lOM， 甲醇85ml，冰醋酸5ml混合固定液固定组织效果较佳。其中Bouin氏固定液不宜使用， 因为它在固定过程中会引起过量水解，使DNA结构被破坏，导致组织切片无色或着色较 浅。组织用酸性脱钙液处理后，亦易导致组织切片染色较淡