免疫组化检测鸭乙型肝炎病毒(DHBV)方法的建立与应用.pdfVIP

繁穴晨曩搴盒雏=次奢诚■赣擎专鳖羹贯盒2006年会谈论文集 免疫缉化检测鸭乙型肝炎病毒(D鼬V)方法的建立和应用 陈宗艳1．2，程安春1．2·，汪铬书1．2，徐大为1．2，陈孝跃1． (1．四Jfl农监尢学动物科援学院禽痛防治研究中心四川，雅安，625014； 2神糖痰病与人类健康四川省重点实验室，四川，雅安，625014) 擒要：本研究跌合DHtlV p诧S区单捷腹水，成劈建立了检洲：DHBsAg的免痰组化检测方法．采集感染 DHISV后12天的肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑等组织，分别进行D瑚姒g免疫纽化定位研究．将所建立的 免疫组化庄甩于检潮拉拳夫定治．疗翻曝晔感染鸭后DI髓I戳堍的分布，以评价拉米夫定治疗DHBV的效果．结 果表嚼，Ⅸ嘲列喙主羹氧遗于肝鳙脸胞策内，多呈弥漫性分布；在胰腺、肾脏、脾脏及大脑中也检测到阳 性细胞分布；拉束戈定治疗纽治疗的第5天，第lO天其阳性信号明显减弱，停药第3天阳性信号增强．本方 法岭建立在亚细胞水平舞花了对病毒表达抗原的定位观察，为阐明嗜肝DNA病毒的复制过程、致病机理及 抗病毒治疗等提供了可靠俄据，为鸭乙型肝炎动物模型的进一步研究提供参考资料． 关糊：鸭乙曩肝炎病毒，免疫组化，定位研究，拉米夫定 ·程安豢和汪铭书势通讯作者 B 鸭乙型肝炎病毒(I兔ckhep喇s Bvirus，HBV)同属嗜肝病毒科。DHBV的毒粒形态、 代袭种，与人乙型脬炎瘸毒(kp鲥j|is 基因组大小、复制方式和相对嗜肝性等与HBV一样【ll，与HBV感染人一样，DHBV感染 鸭后可弓f起急、慢性肝炎，肝硬化等。因而DHBV感染鸭可作为研究HBV的良好动物模型 BJ。本实验以DI-啦V P抛s区单克隆抗体，成功建立了检测DHBsAg的免疫组化检测方法， 在亚细胞水平对DHBV表达的脚融～g抗进行定位检测，以期更加直观的了解DHBV在组 织不同t部位的复制水平，为鹇哽DHBV的致癍机理、抗乙肝药物新药的筛选和药效评价等 提供有力的实验检测手段。 l材料和方法 1．1材料 1．1．1鸭乙型肝炎瘸毒株 四川省重点实验窒提供，-70C保存。 1．1■实赣饕蕾 1日龄天府肉鸭健雏，体重50士59(四川农业大学原种水禽养殖场)。于出孵当日分别经 颈外静脉抽血，用光生物素标记的ormvDNA探针经斑点杂交和液相PCR检测f31筛选出阴 性鸭作为实验动物。 1．1．3抗体篪试裁 抗DHBV PIeS区单抗由四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室提供：超 司；拉米夫定，葛兰素史克制药(苏州)有限公司，lOOmrJ片，批号 1．1．4试验仪善 Allegratm 35型一次性切片刀片 ZIP型高速冷冻离心机(Bckman公司)；FEATHER JEPAN公司1。 (STAINLESS 1．2方法 1．2．1免疫组化检测1DI琢V方法的建立 1．2．1．1载(盖)玻片准备 参照文献【7，8】进行，进行适当改良。清洁的玻璃载玻片浸酸48小时，流动清水洗24 小时，蒸馏水冲洗2次，载玻片浸入1％的APES，浸泡10s，丙酮洗涤，蒸馏水洗一次，备 ．．483．． 禽类传染病 用，经过这一处理的载玻片在多次洗涤中不会掉片。盖玻片用重铬酸钾浸泡2小时，洗净， 95％酒精浸泡后烘干备用。 1．2．1．2免疫组化程序 参照文献[8】进行，将蜡块切成41xm厚，室温下按常规方法脱蜡，逐级水化至水，将切 min，室温下 片上的组织周围的水用吸水纸擦干，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，孵育10 0．0IM PBS(PH7．4)洗5min×3，采用微波修复抗原10mira室温下0．01MPBS(PH7．4)洗