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添加引物法改善 PCR-SSCP 分析 * 1 朱席琳 、牛妮芳*、刘杨、都特、陈冬梅、王心、刘英 中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院 医学分子生物学国家重点 实验室 北京市东单 3 条 5 号 100005 E-mail: liuyingpumc@ 摘 要：背景：PCR 产物中的引物量显著影响 SSCP 带型。目的：探讨添加引物法改善 PCR-SSCP 重复性和灵敏性的机制，并确定最佳引物浓度。方法：HLA-DRB1 引物或非DRB1 引物与DRB1 基因的 PCR 产物分别以摩尔数比 0:1、3:1、6:1、12:1、25:1、50:1、100:1 和 200:1 混合， 变性，行聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显色。结果：HLA-DRB1 引物可以明显改变相应 PCR 产 物的 SSCP 带型，增加其灵敏性。当引物与PCR 产物的摩尔数比达到 200:1 时，PCR-SSCP 分 析的重复性和灵敏性最佳。结论：通过添加适量引物可排除剩余引物对 PCR-SSCP 中间带型 的干扰，明显改善其重复性和灵敏性。 关键词：PCR-SSCP 引物 突变筛查 1. 前言 [1] PCR-SSCP是一种根据单链DNA构象变化筛查突变的方法 。目前研究发现影响SSCP分析 的因素很多，包括：DNA片段长度和GC含量[2] [3] [4] 、电泳温度 、缓冲液成分（包括离子强度和pH) 、 缓冲液的添加物（如：甘油、甲酰胺、聚乙二醇）[5,6] [7] 、聚丙烯酰胺凝胶组分和浓度 等。 一般认为应用PCR-SSCP检测突变时，应尽可能降低非特异扩增，而无需去除反应中未消 耗的引物和dNTP。但有研究发现PCR产物变性前加入相应的上游或下游引物后可明显改变其 SSCP带型和分析灵敏性，推测此序列依赖性引物效应可能是因为引物与单链DNA结合减少其 复性从而增加了单链DNA的量所致 [8,9]。Qiu-Qiong Cai等发现：PCR产物中引物浓度低于 6nM 时对SSCP带型无影响，而常规使用 30-150nM引物进行PCR扩增后的未纯化产物可呈现引物剂 量依赖性SSCP中间带型[10]。此外，我们在筛查基因突变过程中也发现未纯化产物SSCP的重复 性和灵敏性与PCR引物用量密切相关。 本文以 HLA-DRB1 基因启动子片段为例，深入探讨添加引物法改善 SSCP 重复性和灵敏性 的机制。 2 材料与方法 *共同第一作者 1通信作者 1 2.1 PCR 扩增 HLA-DQA1、DRB1 启动子片段的上游、下游引物引物序列 （上海博亚公司合成）分别为： 5’-CAG ACA TGC ACA CAC CAG-3’，5’-CTT TAG GAT CAT CTT CTT CCC AA-3’[11]；5’-AGA TCT GTT TCA GAA GAG GAC CTT CA-3’，5’-CAG GGA GCT TCA GAC ACA CCA T-3’[12]。以 含HLA-DRB1 启动子片段的质粒为模板进行PCR扩增，25μl PCR反应体系包括：10mM KCl， 8mM (NH ) SO ，10mM Tris-HCl （pH 9.0），0.05％NP-40, 1.5mM MgCl ，每种dNTP 80μM，5’ 4 2 4