磷脂酶C活性测定方法及其应用的研究.pdfVIP

维普资讯 哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报 ；989~6点 JOURNALOFHARBIN sTrr啊 EOFT~CHNOLOGY 第3期 ： 挺 ■ 一 ． 遁糕 活性测定方法 碌慕稠 的研究 彭愈袅 周 定 ● ● 惦 扎 s以蛳 lm 31朝 8。 。 捧：af。 要 ； e鞭}三 骚 蘸 谨赣 再币 为基质．用丑pes代替Tris—H。!缓冲灌对磷 《：。 皆随西’活性矗帑巍 大反应连度(、r由71．43nM min增高到 212．76nM ／珥in．用此法证 明了多粘茵索 B增强 PLC话性 ；夹竹桃霉索 的影响和药 物婊度密牙i关． 关键词：碑脂酶C (PLC)；碘基苯磷酸胆碱 LNPPC)：最 大反应速度 fv )多粘营索 B (PolymyxinB),夹竹桃莓索 (olcandomycin)． B．cereusPLC…具有磷脂 酸胆碱 (PC)磷脂酸髓醇 PT)、磷脂 酸乙醇胺 (PE)等活性．PLC活性测定法有多种，Kurioka 第一 个台成 了对—一硝基苯磷酸 胆碱，提出以此为基质测定 PLC的分光光度法．但反应速度很慢，难以测定．经多 次改进 ．如填加 山梨搪薛 ．甘油等加快水解速度 效果仍不 明显．我 NPPC为 基质 ，改变原来 的测活体系，明显地加快 了NPPC的水 解速度 ．并用此溅活体系观 察了多粘菌素B．夹竹桃霉素对 PLC括性的影响． 1 材料与方法 PLC (由B．Cereus获得)、NPPC Hcpes、山梨糖醇 、多粘菌素 B、夹竹桃霉素 (高纯度、具有生物活性) 上为美善 Sigma公司产品．其他试剂均为匡产． PLC活性测定 反应 内容物台 PLC0．02mg／m】，20nM NPPC l0～MZnCI， 20mM Hepes／NaoH (PH 7．2或 7．4)或 0．25M Tris-HC】(PH72)缓 冲液 。60％ 山梨糖醇 ．加或不加抗菌素 总体积为 500~1．用 parafilm将试管密型 ，保温 40分 钟后 ，加 0．5NNaOH 50 1终止酶促反应，或将试管置于冰水中，再加缓冲液 500~1 和 0．5N NaOH500#I后．立即测定吸光度 (4t0nm)． 2 结果与讨论 2．1 敌意孵活体系前后最大反应速度的比较 对照作两组实验．各组均用 5个小试管，在总体积为 50 l的反应物 中．对硝基 苯磷酸胆碱∞浓度分别为 50raM、100raM 150mM 200raM 、300mM．其 中第一 维普资讯 第3期 磷脂酶 C活性测定方法及其应用的研究 ’35’ 组用 Tris-HCI缓冲夜 (PH7．2)并加入 60％山梨糖 酵；第 二组用 Hepcs缓冲液 (PH7．4)．其结果如下： 一 第一组 (表 1) 管 号 l A±S l [ ． E l 0．020 0．14±0．014