通络保肾复方对LPS刺激的肾小球系膜细胞增殖和其TGF—β1表达的影响.pdfVIP

通络保肾复方对LPS刺激的肾小球系膜细胞增殖 及其TGF—pl表达的影响 宇汝翠李楚民刘秀萍北京市中西医结合医院肾病糖尿病中心 肾小球硬化是绝大多数肾小球疾病进展后期的一种不可逆的组织学改变，是肾小球出现损伤后的终末期共同转 归。现代医学抗肾小球硬化的研究和应用虽取得了一定进展，但大多数尚处于实验阶段或仅用于肾小球硬化的动物 模型。中药单昧药及其有效成分提取物、中药复方防治肾纤维化的研究，目前已取得了一定成果，显示了中医药在 抗肾小球硬化方面的良好前景，本研究根据中医“肾络瘀痹”【l】理论，通过采用血清药理学的方法，观察LPS牵O激对 研究通络保肾复方对肾小球硬化的防治作用，从而探索防治肾纤维化的新途径。 一、实验材料 1实验细胞 大鼠肾小球系膜细胞株(GMCs)I扫美国维恩大学张玉祥教授馈赠。 2主要试剂 脂多糖(Lipopolysaecharide，LPS)：Sigma公司生产： bromide，Ma 四甲基偶氮唑盐[3一(4，5一dimethyl·thiazol-2一yt)，2，5-diphenyltetrazliumrl=Sigma公司生产。 显色浓缩液，购自北京中山生物技术有限公司。 3药物 中药通络保肾复方由北京市中西医结合医院中药房提供；缬沙坦胶囊：规格：80rag／片。为北京诺华制药公司产品。 产品批号SD26003。 4主要仪器 (1)恒温C02培养箱(HeraeusEK／COBB2BB)：德国产； typeB5060 (2)倒置显微镜(Olympus)：日本奥林巴斯公司生产： (3)450型自动酶标仪(MuLtiskanAscentVI．24345．00627T)；美国百特公司生产。 =、实验方法 1．含药血清的制备 将通络保肾复方按成人临床用量的3．5倍、7倍、14倍，缬沙坦取临床月量的7倍，分别绘正常Wistar大鼠 56(2水浴灭活，30min，并用针孔滤器(O．221上In)除菌，分装于离心管中，置于-20℃冰箱备用。 2．细胞复苏 (1)从．70℃冰箱中取冻存有细胞的冻存管，手中快速搓动成冰水混合物；(2)加不含血清的DMEM量为0．5ml。 于恒温c02培养箱中。 3．细胞传代 (1)从恒温C02培养箱取出培养瓶，镜下观察细胞生长至对数生长期；(2)0．25％胰蛋白酶消化，镜下观察待细胞 培养瓶： (5)置于恒温C02培养箱培养。 4，细胞分组 (1)空白组：5％小牛血清+DMEM= (2)LPS组：5％小牛血清+DMEM+LPS； (3)缬沙坦组：5％缬沙坦组含药血清+DMEM+LPS； (5)通络保肾小剂量组：5％通络保肾小剂量组含药盘清+DMEM+LPS： 550 l《≯第21次中华中医药学会肾病分会学术会议论文汇编 (6)通络保肾中剂量组：5％通络保肾中剂量组含药血清+DMEM+LPS (7)通络保肾大剂量组：5％通络保。肾大剂量组含药血清+DMEM+LPSt 5．倒置显微镜下观察GMCs细胞形态变化 6．MTT法检测细胞增殖 孔；(4)细胞继续培养12h、24h、48h、60h后吸出培养液，各孔加／X．200IM浓度为5mg／ml的MTT： DMSO还原的MTT结晶； (5)37。C继续培养4h：(6)吸出培养液，每孔加A．2009l (7)在酶标仪上检测波长为570rim的光密度值。实验重复5次。 7．Western．blot (1)胞浆蛋白提取。肾小球系膜细胞株由5％小牛血清DMEM培养传代。于实验前采用无血清DMEM同步24h， 备用。 (2)步骤。取上清蛋白液与等体积2×上样缓冲液混匀后100℃煮沸5分钟，于SDS．PAGE凝胶上进行电泳分离， 500)室温孵育2h，洗膜后DAB显色，特异性条带显黄色。 7．统计方法 实验结果采用工：Is表示，所有实验数据均采用统计软件SPSSll．5进行单因素方差分析。 三、实验结果 1．GMCs细胞形态 倒置相差显微镜下，肾小球系膜细胞呈现明显