限制性内切酶及PCR技术与中药生物鉴定.docVIP

限制性内切酶PCR技术与中药生物鉴定 中药的鉴定和质量控制是中医药研究的基础，选择最佳的方法、手段鉴定和评价中药是新药开发的重要环节。但由于经济实力和技术手段等多方面原因，使中药鉴定目前面临许多问题 因此，人们把着眼点放在了高新技术开发上，我们可选择中药复方或中成药为载体，运用DNA遗传标记鉴定方法，通过对各药遗传标记特征的提炼、整合研究，确立其专属性的评价指标和数据库，构建其综合评价的模式，并尝试为进一步控制中成药的质量提供科学的方法和适用技术。中药生物鉴定法是近年来兴起的一种中药品质鉴定新方法，它和传统的基原鉴定法、性状鉴定法、显微鉴定法、理化鉴定法一起，并称为中药的五大鉴定法。生物鉴定法具有先进性、适用性、可操作性和专属性强等特征，并且能够突出中药的药效学作用，准确性高。中药生物鉴定法为中药质量现代化和质量标准规范化的研究提供了新思路。但目前此方法尚处于起步阶段，在具体实施中相关方法和技术还有待于进一步完善。 限制性核酸内切酶识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。根据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无特异性的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割。这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列，也就是在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。在基因工程中使用的多数是后一类酶。限制酶在特定切割部位进行切割时，按照切割的方式，又可以分为错位切和平切两种。错位切一般是在两条链的不同部位切割，中间相隔几个核苷酸，切下后的两端形成一种回文式的单链末端，这个末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA片段连结，故称为黏性末端。这种酶在基因工程中应用最多。另一种是在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。聚合酶链式反应简称PCR。是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方． 技术原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在 实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 生物鉴定法就是利用药效学和分子生物学等有关技术来鉴定中药品质的一种方法，通常分为生物效应鉴定法和基因鉴定法两大类。DNA遗传标记鉴定法主要运用分子遗传学技术，如对鸡内金与鸭内金的鉴别，可利用微量DNA提取技术，从测试药材中提取DNA，进行DNA碱基序列测定，最后鉴别出真伪mRNA差异显示鉴定法是利用中药不同组织或细胞在基因表达上的差异进行鉴定的一种方法。主要通过将总RNA反转录成单链cRNA，然后进行PCR扩增反应，分离出不同分子大小的DNA，挑选出有差异的表达基因进行序列分析。采用该技术可提炼出栽培和野生、道地与普通药材之间的特征，可望广泛用于中药品种鉴定。中药生物鉴定法侧重中药的品质和临床用药的安全性、有效性等的有机结合的研究，可以配合其他鉴定方法综合解决中药品质鉴定的难题，并尝试为中医与中药现代化的结合找到突破口。