高灵敏催化荧光分析法探究生物体内活性氧自由基ONOO-.pdfVIP

—— 塞墨竺堡竺茎堂坌塑苎!窒竺塑竺塑重堡璺皂虫苎!竺旦旦： ：!!!： 高灵敏催化荧光分析法研究生物体内活性 氧自由基ONOO一冰 郑琦Ⅵ刘志宏2蔡汝秀2 (1．江汉大学化学与环境工程学院湖北·武汉430052) (2．武汉大学化学与分子科学学院湖北·武汉430072) 摘要本文采用酶催化动力学分析法研究了过氧亚硝酸的氧化行为．提出了一种催化荧光光谱测定 过氧皿硝酸的新方法。方法根据肌红蛋白所具有的模拟酶性质催化氧化酪氨酸，产生一种具有荧光特性的产 物酪氨酸二聚体，研究了反应的动力学行为并提出了反应的可能机理，酪氨酸的二集体可能是ON00在体 内造成损伤的另一标志物。在实验选定的最佳反应条件下，该反应体系的荧光强度与ONOO一的浓度在600 ×lff 7—3．00×1矿mol／L范围内呈良好的线性关系，检出限为8．20×lff8tool，L。 关键词过氧亚硝酸荧光光谱分析酶催化动力学肌红蛋白 1引言 活性氧中间体与人类的健康和疾病密切相关，是当前生命科学研究的热点”。。近年来的 物，ON00一性质活泼，氧化性强，在生物体内，ON00能对细胞产生厂’泛的生物学效应， 与许多生物分子发生反应，氧化脱氧核酸、脂质和引起巯基的过氧化。由于ON00一在生物 体内的浓度很低并且存在的时间相当短，因此，生物体内ON00的检测是十分困难的。由于 过氧亚硝酸存在于生物体内并起着重要的作用，因此寻找一种适合在生物体内的检测方法 就显得非常重要。 已有的文献认为，酪氨酸被过氧亚硝酸硝化生成硝基酪氨酸，它所具有的光谱性质通常作为 检测过氧亚硝酸的指标o“，硝基酪氨酸被认为是生物体内受到ON00一损伤的标志物。根据 我们利用酶催化反应研究活性氧所作的一些工作5。”，生物体内的肌红蛋白可以用作辣根过 的催化下直接氧化酪氨酸，产生具有强烈荧光的二聚体产物，其发射波长在410．0nm， 而 氧化蛋白质的产物。由于肌红蛋白是生物体内的天然蛋白质，它很可能与ONOO一在细胞或 生物体内共存，所以，我们认为酶催化反应可能是ON00一在体内损伤细胞或其它组织特别 是含有酪氨酸残基的物质的另外一种途径。并据此建立了一种高灵敏和选择性较好的测定 血清样品进行了测定，结果较为满意。 2实验部分 +国家自然科学基金(N020275027)和湖北省自然科学基金(No．2004ABAl82)的资助 -268· 化学与化工技术 2．1试剂与仪器 国)；超氧歧化酶(SOD，3000UmUl，Sigma公司，美国)；o．1 所有溶液均置于冰箱(4℃)保存；o．20 水，其它试剂均为分析纯。 2．2过氧亚硝酸阴离子10NOO一)的测定方法 (100X 定容到刻度，溶液的荧光强度在Eex／em=317nm／406nm条件下进行测定。 3结果和讨论 31 反应体系的荧光光谱图 底物酪氨酸具有内在荧光，它的最大激发和发射波长相应为225．0nlla和305．0nm，在 有新的荧光物质产生(图2)，其荧光激发光谱位于320．0Iqm，最大发射波长为410．0nm。 型 蝈 舞 州 童 话 蜘瑚{戛渤瑚啪咖勋。锄 440 480 300320340360380400420 460 波长fnm)